實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用摘要:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過(guò)檢測(cè)PCR產(chǎn)物中熒光訊號(hào)強(qiáng)度來(lái)達(dá)成定量的目的,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，并且與常規(guī)PCR相比，它含有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),現(xiàn)在已在動(dòng)植物基因工程，微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用.本文對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理，檢測(cè)辦法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了評(píng)述,重點(diǎn)及創(chuàng)新點(diǎn)是對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，食品行業(yè)，植物方面的應(yīng)用進(jìn)行了比較全方面的綜述，并對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的普及應(yīng)用及領(lǐng)域的前景做了進(jìn)一步的展望.核心詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR；應(yīng)用;展望Researchprogressandapplicationofreal—timePCRtechnologyAbstract：Real—timePCRtechnologytodetectPCRproductbyfluorescencequantitativesignalstrengthtoachievethepurpose,thetechnologynotonlytoachievethePCRfromqualitativetoquantitativeleap，andcomparedwithconventionalPCR，itismorespecific,effectivesolutiontoPCRcontaminationproblem,degreeofautomation,hasbeenwidelyusedingeneticengineeringofplantsandanimals，microbesandmedicinefields。Inthispaper，theprincipleofreal—timePCRtechnology，principles，testingmethods，advantagesanddisadvantagesarereviewed，thefocusandinnovationisareal—timePCRtechnologyinthefieldofmedicine,foodindustry，plantaspectsoftheapplicationofamorecomprehensiveoverview，prospectsandreal—timePCRtechnologyinthefieldofuniversalapplicationandmadeafurtheroutlook.Keywords:Real-timequantitativePCR；application;Outlook聚合酶鏈反映(PCR）技術(shù)自1985年問(wèn)世以來(lái)，以其敏捷性高、特異性強(qiáng)和速度快在分子生物學(xué)等科研領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是，由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能精擬定量,在操作過(guò)程中易受污染而使假陽(yáng)性率偏高；因此，使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)擁有特異性強(qiáng)、敏捷度高、重復(fù)性好、定量精確、速度快、全封閉反映等優(yōu)點(diǎn)，已成為了分子生物學(xué)研究的重要工具.文章對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理、檢測(cè)辦法、定量辦法及其應(yīng)用進(jìn)行了綜述。1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)概述1.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反映體系中加入熒光基團(tuán),運(yùn)用熒光積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)原則曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的辦法[1].實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在反映體系中加入熒光基團(tuán)，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線如圖1.在PCR反映早期,不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最后的平臺(tái)期，因此能夠在指數(shù)期的某一點(diǎn)上檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量,并由此推斷起始模板含量。為了精確判斷樣品中某基因產(chǎn)物的起始拷貝數(shù)，熒光定量PCR采用參數(shù)“Ct”值，Ct值也稱閾值循環(huán)(thresholdcycle），指PCR循環(huán)過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增加階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù),也就是每個(gè)反映管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)成設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù).研究成果表明,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小[2］。運(yùn)用已知起始拷貝數(shù)的原則樣品可作出原則曲線,因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從原則曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)［3］。圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原則擴(kuò)算曲線1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的檢測(cè)辦法實(shí)時(shí)熒光技術(shù)PCR是在擴(kuò)增產(chǎn)物聚集的過(guò)程中持續(xù)檢測(cè)，即“實(shí)時(shí)”檢測(cè),根據(jù)在指數(shù)擴(kuò)增期的產(chǎn)物量來(lái)推算初始模板的拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR涉及探針類和染料類兩種,探針類是運(yùn)用與靶序列特異雜交的探針來(lái)批示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。染料類如SYBRGreenI則是運(yùn)用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特性批示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別環(huán)節(jié)特異性更高；但后者則簡(jiǎn)便易行、成本較低。1.2。1熒光標(biāo)記探針按其基團(tuán)標(biāo)記和能量轉(zhuǎn)移的方式，現(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)出幾個(gè)有關(guān)的技術(shù)，大致能夠分為水解探針和雜交探針兩類。如TaqManTM探針（水解探針)、TaqmanMGB（水解探針)（Dual—oligoFRETpairs(雙雜交探針)、Molecularbeacons(雜交探針)、UniversalprobelibraryLNA(lockednucleicacids（水解探針)、Simpleproble探針等[4］。（1）TaqMan探針該探針是長(zhǎng)度為20—24b的寡核苷酸,在其5’末端標(biāo)記1個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán),3'末端標(biāo)記1個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，其序列與2個(gè)引物包含序列內(nèi)的1段DNA模板完全互補(bǔ)。該辦法是當(dāng)探針保持完整時(shí)運(yùn)用Taq酶(5'→3'外切酶)的活性淬滅基團(tuán)吸取發(fā)射的熒光。當(dāng)有特異的PCR發(fā)生時(shí)，Taq酶發(fā)揮其5’→3’外切酶活性，將與模板雜交的探針切碎，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，淬滅作用被解除，熒光信號(hào)釋放，通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)就能夠觀察到信號(hào)的變化，熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成呈正有關(guān)。每擴(kuò)增1條DNA鏈，就有1個(gè)游離的熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同時(shí).運(yùn)用原則模板系列繪制出原則曲線，結(jié)合各樣品的Ct值,能夠擬定樣品的起初模板量［5]。由于探針與目的片段之間的特異雜交產(chǎn)生熒光信號(hào),因而此辦法可通過(guò)探針增強(qiáng)檢測(cè)的特異性,且能夠提供多重檢測(cè)功效.（2）TaqmanMGBTaqmanMGB探針是Taqman探針的基礎(chǔ)上改善的，在探針的3'端增加了MGB（minorgroovebinder)分子,這種物質(zhì)能夠結(jié)合在雙鏈DNA小溝部位；MGB提高了探針的TM值，從而使它能夠分辨1個(gè)堿基的差別：完全配對(duì)，有熒光信號(hào)；一種堿基不匹配,則沒(méi)有信號(hào)；并且連在MGB分子后的是非熒光物質(zhì)的淬滅基團(tuán)，因此這種探針含有更加好的淬滅效果且無(wú)背景熒光、熒光標(biāo)記靈活、提高熒光信號(hào)的信噪比、提高退火溫度、探針短、提高SNP識(shí)別率等優(yōu)點(diǎn)。從而含有了更加廣泛的應(yīng)用前景。（3)分子信標(biāo)分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾構(gòu)造的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，環(huán)部大小為15—35bp,能與靶DNA序列互補(bǔ)，莖部由GC含量較高的與靶DNA無(wú)序列同源性的互補(bǔ)序列構(gòu)成，探針的5'端與3’端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)分子信標(biāo)處在自由狀態(tài)時(shí),發(fā)夾構(gòu)造的2個(gè)末端靠近，使熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)靠近，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET）效應(yīng)，熒光信號(hào)被淬滅;因此,檢測(cè)不到熒光信號(hào)［6］.當(dāng)有靶序列存在時(shí)，分子信標(biāo)與靶序列結(jié)合，使分子信標(biāo)的發(fā)夾構(gòu)造打開(kāi)呈線型，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的距離，此時(shí)熒光報(bào)告基團(tuán)不能被淬滅，熒光檢測(cè)儀器可檢測(cè)到熒光。隨著每次擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，熒光強(qiáng)度增加，可反映出每次擴(kuò)增末擴(kuò)增產(chǎn)物積累的量.分子信標(biāo)法的特點(diǎn)是探針可循環(huán)運(yùn)用，合用于檢測(cè)點(diǎn)突變，特異性更明顯.但探針標(biāo)記較復(fù)雜，并且規(guī)定其游離在溶液中時(shí)探針能無(wú)選擇性折疊,當(dāng)莖構(gòu)造的熱力學(xué)溫度過(guò)高時(shí)還會(huì)影響探針與靶序列雜交.（4）雙雜交探針雙雜交探針技術(shù)是Roche公司開(kāi)發(fā)的一種PCR定量技術(shù)，使用2個(gè)雜交探針，能提高特異性。該技術(shù)是將2條探針中的1條在5'端標(biāo)記熒光,1條在3'端標(biāo)記熒光，其中一種為受體熒光基團(tuán)，另一種為供體熒光基團(tuán)，2個(gè)探針可與模板同1條鏈相鄰的序列雜交。在自由狀態(tài)時(shí),供體熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜覆蓋受體熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜;因此，只能檢測(cè)到供體熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光.在PCR退火階段中2條探針與目的基因特異性結(jié)合，首尾連接，使供體和受體熒光距離非?？拷瑑烧弋a(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使受體熒光基團(tuán)發(fā)出熒光.由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針是靠近發(fā)光，因此檢測(cè)信號(hào)是實(shí)時(shí)信號(hào)，而非累積信號(hào)。該辦法的特點(diǎn)是淬滅效率高，但由于2個(gè)探針結(jié)合于模板上；因此，會(huì)影響擴(kuò)增效率，并且需要合成2個(gè)較長(zhǎng)的探針，合成成本相對(duì)較高.(5）Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicAcids）新近Roche公司研發(fā)并建立了人類和鼠的通用探針庫(kù),其探針是由鎖定核酸構(gòu)成。他們通過(guò)分析人的轉(zhuǎn)錄組中全部不同的可能的8至9堿基序列,按照他們?cè)谵D(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的頻率分類，找出最普便的8至9堿基序列模式制備成通用探針；每一種探針能夠與7000個(gè)轉(zhuǎn)錄子雜交。這種探針的特異性由探針和引物共同實(shí)現(xiàn)。LNA是一種雙RNA聚合的類似物，其2p—位的氧原子與核糖4p—碳原子形成亞甲基的橋鍵,并分別在5p和3p標(biāo)記上熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)；LNA單體摻入寡核苷序列能夠增加形成體的Tm值，其穩(wěn)定性比PNA高（PNAS,97：5633—5638)1因LNA與DNA雜交較DNA與DNA、DNA與RNA甚至PNA與DNA雜交有更高的親和性，故這種探針?lè)€(wěn)定性最佳；并且探針實(shí)現(xiàn)了設(shè)計(jì)快速簡(jiǎn)樸、低成本的水解探針特點(diǎn)。普通上其公司網(wǎng)站后,輸入基因序列號(hào)，就能訂制，無(wú)需檢測(cè)引物二聚體和非特異性片段。因此LNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高熔點(diǎn)和高特異性結(jié)合特點(diǎn);能夠用于全部的熒光定量PCR儀。（6）Simple探針近來(lái)Roche公司生產(chǎn)一種簡(jiǎn)樸探針，這種探針只在5'端標(biāo)有報(bào)告熒光，在報(bào)告熒光和5’端之間連接一種稱作“l(fā)inker”的構(gòu)造，只有在變性階段,探針與目的序列互補(bǔ)結(jié)合時(shí),引發(fā)“l(fā)inker”構(gòu)造發(fā)生變化,從而報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光得以顯現(xiàn)。這種探針的好處是不用淬滅基團(tuán)，從而無(wú)背景熒光。1。2.2雙鏈DNA（現(xiàn)在用于實(shí)時(shí)PCR的dsDNA結(jié)合染料，重要有SYBRGreenI和LCGreenTMI［7］。（1)SYBRGreenI是一種非飽和菁類熒光素,能夠嵌合于DNA雙鏈構(gòu)造的小溝中.其處在游離狀態(tài)時(shí)，檢測(cè)不到熒光信號(hào),當(dāng)結(jié)合dsDNA后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),即被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到,熒光強(qiáng)度的增加與初始模板量有關(guān)，能夠進(jìn)行定量DNA分析,已有應(yīng)用于臨床診療和科學(xué)研究中的報(bào)道。SYBRGreen染料法與探針?lè)ㄏ啾?其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)辦法簡(jiǎn)便，同時(shí)減少了檢測(cè)成本。但是,由于該染料能夠結(jié)合任何dsDNA分子，因此不能確保PCR的特異性。能夠通過(guò)優(yōu)化PCR的反映條件，減少或去除非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生,另外,也能夠借助融解曲線分析法來(lái)分辨非特異性產(chǎn)物和引物二聚體而進(jìn)行定性診療。(2）LCGreenTMI是最新出現(xiàn)的一種dsDNA結(jié)合染料,與SYBRGreenI相比,該染料是一種飽和結(jié)合染料，能夠完全結(jié)合dsDNA分子，可直接加入PCR反映體系中，高濃度的LCGreenTMI不會(huì)克制PCR反映。已有文獻(xiàn)報(bào)道在PCR反映體系中加入LCGreenTMI，使用一對(duì)引物，一種不作標(biāo)記的探針,結(jié)合常規(guī)融解曲線或僅使用一對(duì)引物,PCR結(jié)束后通過(guò)分析融解曲線的形狀和融解溫度(Tm值）的大小，對(duì)純合子和雜合子以及寡核苷酸序列多態(tài)性（SNP）進(jìn)行鑒別。LCGreenTMI染料法簡(jiǎn)便、快速、精確性高，預(yù)期將會(huì)有較好的應(yīng)用前景。1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展PCR技術(shù)發(fā)明以來(lái)，研究人員始終致力于用其進(jìn)行核酸精擬定量。1991年Holland等[8］初次運(yùn)用不可延伸的寡核苷酸雜交探針與模板結(jié)合，然后運(yùn)用DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性將探針切斷，使探針的能量傳遞構(gòu)造被破壞發(fā)出熒光來(lái)定量PCR產(chǎn)物。1992年Higuchi等［9，10]在PCR反映管中加入EB,反映進(jìn)行過(guò)程中，PCR產(chǎn)物增加，EB與DNA雙鏈結(jié)合發(fā)出熒光強(qiáng)度也逐步增加.他們通過(guò)持續(xù)攝影動(dòng)態(tài)觀察熒光強(qiáng)度的變化,并以此定量PCR產(chǎn)物的多少，成為最早的實(shí)時(shí)定量PCR。1996年Heid［11］等首先報(bào)道了TaqmanPCR的原理及辦法。同年,美國(guó)AppliedBiosystems公司推出商用實(shí)時(shí)定量PCR（TaqmanPCR）系列。之后,人們又設(shè)計(jì)出不同的熒光探針,如分子信標(biāo)技術(shù)(molecularbeacon）[12］、LightcyclerPCR［13，14］等。隨著研究的不停進(jìn)展,研究人員不僅定量DNA分子，還定量RNA分子,從而進(jìn)一步定量基因的體現(xiàn)［15]。1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量辦法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量辦法有2種,即絕對(duì)定量法和相對(duì)定量法［16]。絕對(duì)定量法是用已知的原則曲線來(lái)推算未知的樣本量;相對(duì)定量法是在一定樣品中靶序列相對(duì)于另一參考序列量的變化，由于每個(gè)模板Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，運(yùn)用已知起始DNA濃度的原則品即可繪制出原則曲線.1。4。1絕對(duì)定量法絕對(duì)定量法指的是用已知的原則曲線來(lái)推算未知樣本的量，此辦法要預(yù)先懂得原則品的濃度。將原則品稀釋成不同濃度并作為模板進(jìn)行PCR反映，以原則品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)繪制出原則曲線。對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)根據(jù)未知樣品的Ct值，即可從原則曲線中推出樣品的起始拷貝數(shù).1.4。2相對(duì)定量法（1)比較原則曲線的相對(duì)定量法相對(duì)定量法指的是在一定樣本中靶序列相對(duì)于另一參考樣本量的變化。由于該辦法中量的體現(xiàn)是相對(duì)于某個(gè)參考物而言的；因此，相對(duì)定量法的原則曲線比較容易制備，對(duì)于所用的原則品只需懂得其稀釋度即可。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中,待測(cè)樣本靶序列的量來(lái)自原則曲線，最后必須除以參考物的量，其它的樣本為參考物量的n倍.在實(shí)驗(yàn)中為了精確加入反映體系的RNA或DNA，普通在反映中擴(kuò)增1個(gè)內(nèi)源管家基因作為參考基因，由于管家基因在多個(gè)組織中的恒定體現(xiàn)，因此可用來(lái)作為原則,比較來(lái)源不同的樣本目的基因體現(xiàn)量的差別.管理基因是用于比較目的基因拷貝數(shù)，根據(jù)內(nèi)參考賠償待測(cè)樣本核酸抽提過(guò)程中造成的目的基因損失，反映體系內(nèi)與否存在擴(kuò)增克制因素及參考物原則化等［17].（2）比較Ct值的相對(duì)定量法該辦法是同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)靶基因片段和內(nèi)參考基因片段。這2個(gè)擴(kuò)增反映能夠在2個(gè)反映管中分別進(jìn)行，也能夠在同1個(gè)反映管中進(jìn)行，測(cè)得兩者的Ct值之差即ΔCt。該辦法不需要原則曲線，與原則曲線法不同之處在于其運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加1倍的產(chǎn)物,以PCR反映的指數(shù)期得到Ct值來(lái)估算起始模板的量，一種循環(huán)（Ct=1)相稱于起始模板數(shù)的2倍。此辦法節(jié)省試劑,操作簡(jiǎn)便，但由于是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致為前提的,效率的偏移會(huì)影響對(duì)實(shí)際拷貝數(shù)的預(yù)計(jì)；因此，如何優(yōu)化反映體系,使得目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等是該辦法的難點(diǎn).2．實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用。2.1醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的運(yùn)用應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病原DNA不僅能夠定性,還能夠檢測(cè)出病原量的多少,為臨床診療提供了強(qiáng)有力的根據(jù).現(xiàn)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)應(yīng)用于許多病原體的檢測(cè)，例如乙型肝炎病毒DNA［18］、鋒利濕疣皮損中HPVD—NA[19］、與鼻咽癌關(guān)系親密的EB病毒（Epstein-Banvirus)［20]、豬內(nèi)生逆轉(zhuǎn)錄酶病毒［21]。Andersen等［22]用定量PCR的辦法測(cè)定了結(jié)直腸癌淋巴結(jié)的癌胚抗原（CEA)mRNA的體現(xiàn)量，可作為診療癌癥微轉(zhuǎn)移的重要根據(jù)。Cassinat等[23]應(yīng)用RQ-PCR對(duì)t（15;17）NB4白血病細(xì)胞進(jìn)行了研究,其敏感性達(dá)10-6.Pongers-Willemse等［24]首先應(yīng)用RQ—PCR對(duì)4例前B細(xì)胞ALL中IgH/TCR重排進(jìn)行了研究,他們針對(duì)每個(gè)病例設(shè)計(jì)一種與連接區(qū)互補(bǔ)的等位基因特異性寡核苷酸(ASO）探針和各自特異性的一對(duì)引物，比較了RQ-PCR與斑點(diǎn)雜交和液相雜交檢測(cè)的敏感性.成果發(fā)現(xiàn)其敏感性與斑點(diǎn)雜交相似(10—3~10-5),但低于液相雜交.劉敬忠等報(bào)道使用dsDNA結(jié)合染料SYBRGreenI，結(jié)合融解曲線分析對(duì)A-地中海貧血純合子、雜合子作出診療［25]。使用雙色熒光標(biāo)記探針,結(jié)合不同的引物設(shè)計(jì)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)某些先天性疾病的定量檢測(cè).趙衛(wèi)東等［26］通過(guò)熒光定量的辦法對(duì)各細(xì)胞株的轉(zhuǎn)錄因子T-boxex—pressioninTcells（T-bet）、GATA3的體現(xiàn)水平進(jìn)行檢測(cè)，建立了腫瘤細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄因子基因體現(xiàn)的熒光定量PCR檢測(cè)辦法，較常規(guī)PCR辦法更為簡(jiǎn)便、快速、精確,有較好的應(yīng)用前景。2.2食品研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能夠?qū)κ称分兄虏【M(jìn)行檢測(cè)。李光偉［27]等采用沙門(mén)菌fimY基因序列，設(shè)計(jì)特異引物和探針，建立了檢測(cè)食品中沙門(mén)菌的FQ—PCR辦法。胡建華等根據(jù)Grenbank公布的志賀菌ipaH基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，篩選適宜的DNA模板制備辦法嗎,以SABHGreen染料監(jiān)控?zé)晒庾兓腇Q-PCR與常規(guī)PCR結(jié)合，檢測(cè)培養(yǎng)液和牛奶陽(yáng)性樣品中的志賀菌［28]。FQ—PCR技術(shù)除了在微生物檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，也是食品微生物研究中不可缺少的工具，是作為微生物生理代謝、菌群分布、菌株鑒定等的研究工具.同時(shí)PCR技術(shù)是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品最方便快捷的辦法，基于轉(zhuǎn)基因特異DNA片段的FQ-PCR篩選辦法已被某些國(guó)家作為有關(guān)食品法規(guī)的原則檢測(cè)辦法。日本和美國(guó)等13個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合采用FQ—PCR辦法對(duì)5種轉(zhuǎn)基因玉米和1種轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了定量研究。成果表明這種辦法能夠應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)記制度的實(shí)際檢測(cè)[29］。2。3植物研究上的運(yùn)用傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)辦法依賴于癥狀觀察、孢子或菌落計(jì)數(shù)等手段.與傳統(tǒng)辦法相比，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)含有快速、敏捷、特異等優(yōu)點(diǎn)，不受植物癥狀的限制，能分辨細(xì)微差別。現(xiàn)在該技術(shù)在植物病原菌檢測(cè)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。如伍永明等[30］根據(jù)西瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovoraxavenaesubsp。citrulli)與有關(guān)細(xì)菌16SrDNA序列差別，設(shè)計(jì)出對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病菌含有穩(wěn)定點(diǎn)突變特異性探針Aac-probe,運(yùn)用該探針對(duì)23種供試菌株進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn).植物抗病性及其機(jī)制研究始終是當(dāng)今植物病理學(xué)和植物抗病育種研究工作中的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問(wèn)題。而抗病基因的研究是植物抗病性及其機(jī)制研究的基礎(chǔ)，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)可檢測(cè)轉(zhuǎn)入抗病基因的植株中病毒的積累［31]，從而比較抗病植株與感病植株之間的病毒復(fù)制和積累的差別,為抗病基因克制病毒的復(fù)制和運(yùn)動(dòng)提供強(qiáng)有力的分子證據(jù)。3．實(shí)時(shí)熒光定量PCR的展望實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)自1996面世以來(lái),短短的幾年就被廣泛應(yīng)用到生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域,涉及到的范疇涉及DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態(tài)性分析,基因突變分析等多個(gè)領(lǐng)域。但隨著該技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域范疇不停擴(kuò)大延伸,研究的層次不停進(jìn)一步,它也開(kāi)始顯現(xiàn)出局限性:（1)減少探針制備的成本或發(fā)掘新的熒光染料；（2)進(jìn)一步提高分析的敏捷度及實(shí)驗(yàn)重復(fù)性；(3)樣品制備簡(jiǎn)樸化，程序化和機(jī)械化以節(jié)省時(shí)間減少成本.相信，實(shí)時(shí)熒光定量PCR將以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在分子生物學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面發(fā)揮更多更大的作用。另外，基因分析的定量化和均相化是將來(lái)基因診療的發(fā)展趨勢(shì),現(xiàn)在在該領(lǐng)域的研究剛剛開(kāi)始，仍有許多問(wèn)題需要解決,如分析敏捷度及重復(fù)性問(wèn)題、自動(dòng)化儀器和試劑成本、樣品解決及多基因同時(shí)分析等問(wèn)題.生物芯片技術(shù)與熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合將有助于上述問(wèn)題的解決[32］，屆時(shí)將大大推動(dòng)該技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用普及,特別是臨床診療領(lǐng)域的推廣.隨著科學(xué)技術(shù)與科學(xué)知識(shí)的增加，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)將繼續(xù)被改善，新的問(wèn)題被攻克，從而建立更新、更便捷、更完善的PCR體系,并應(yīng)用到更廣、更深的科學(xué)領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)[1］歐陽(yáng)松應(yīng),楊冬，歐陽(yáng)紅生等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].生命的化學(xué),,24(1):742－761.［2]VerderioP，PizzaMiglioS，GalloF，etal.FCI:anR－basedalgorithmforevaluatinguncertaintyofabsolutereal－timePCRquantification［J］.BMCBioinformatics，，9:13.［3]WolfgangK，JonathanN，KarasS，etal1Fluorogenicprimersforreal-timePCRAmericanBiotechnologyLaboratory,,(7）：52—56[4]王愛(ài)民。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan)法測(cè)定外源基因的拷貝數(shù)［J］。廣西植物,，29(3）:408－412。［5］BonnetG,TyagiS，LibchaberA，etal。ThermodynamicbasisoftheenhancedspecificityofstructuredDNAprobes［J]。ProcNatlAcadSciUSA,1999,96：6171－6176。［6］BrechtbuehlK，WhalleySA,DusheikoGM，etal.Arapidreal－timequantitativepolymerasechainreactionforhepatitisBvirus[J].JVirolMethods,,93(1/2）：105－113。［7］WittwerCT，ReedGH，GundryCN，etal。1High-resolutiongenotypingbyampliconmeltinganalysisusingLCGreen1ClinChem，，49(6）:853-860。［8]HollandPM，AbramsonRD,WatsonR,etal。Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5’—3'exonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991，88:7276－7280。［9]HiguchiR，DollingerG,WalshPS，etal.SimultaneousamplificationanddetectionofspecificDNAsequences.Biotechnology,1992，10：413。[10]HiguchiR,FocklerC，etal。KineticPCRanalysis:real—timemonitoringofDNAamplificationreactions。Biotechnology,1993,11：1026－1030。[11］HeidCA,StevensJ，LivakJK，etal。Real－timequantitativePCR[J]。GenomeRes,1996,6：9862－9941。[12]TyagiS,KramerFR.Molecularbeaconsprobes：thatfluoresceuponhybridization。NationalBiotechnology,1996，14:303－308.［13］WittwerCT,HerrmannMG,MossAA,etal.ContinuousfluorescencemonitoringofrapidcycleDNAamplification.Biotechniques，1997,22:130－138。［14］WittwerCT，RirieKM，AndrewRV，etal.Thelightcycler:amicrovolumemultisamplefluorimeterwithrapidtemperaturecontrol.Biotechnique，1997，22：176－181.［15］MayerZ,FrberP，GeisenR.MonitoringtheproductionofaflatoxinB1inwheatbymeasuringtheconcentrationofnor—1mRNA。AppliedandEnvironmentalMicrobiology，,69（2）:1154－1158。［16]鄧文星，張映.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)綜述[J].生物技術(shù)通報(bào)，，27(5）：93－96。［17]胡秀華,何苗,劉麗等。水中輪狀病毒實(shí)時(shí)定量PCR外原則品的構(gòu)建［J]。環(huán)境科學(xué)，，29（2):380－385。[18]CuiZ,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