人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則03月20日公布

本要點(diǎn)合用于供治療的體內(nèi)診療用的運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體，合用于在人體內(nèi)應(yīng)用的運(yùn)用重復(fù)DNA技術(shù)制備的基因工程抗體。

一、雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體

（一）雜交瘤細(xì)胞

1．親本細(xì)胞

（1）骨髓瘤細(xì)胞

SP2/0或其它適宜的骨髓瘤細(xì)胞系。應(yīng)為不合成或不分泌免疫球蛋白鏈型，含有符合骨髓瘤細(xì)胞的染色體特性，并有明確的來源歷史及符合規(guī)定的保存條件。

（2）免疫親代細(xì)胞

經(jīng)抗原免疫的鼠脾B淋巴細(xì)胞或外周血B淋巴細(xì)胞。

應(yīng)有明確的免疫原來源、性質(zhì)及動物種系，免疫原具體的制備過程。

適宜的免疫方案及免疫淋巴細(xì)胞制備的辦法。

2．細(xì)胞融合與克隆化

采用適宜的辦法進(jìn)行融合、篩選及克隆化。

3．雜交瘤細(xì)胞檢定

（1）抗體分泌穩(wěn)定性

持續(xù)克隆化后抗體陽性率達(dá)100%，經(jīng)體外持續(xù)傳代3個(gè)月以上和重復(fù)凍存、復(fù)蘇，細(xì)胞系能保持穩(wěn)定分泌特異性抗體。

（2）細(xì)胞核學(xué)特性

檢查細(xì)胞分裂中期染色體，應(yīng)符合雜交瘤細(xì)胞特性。

4．鼠源病毒檢查

按附錄規(guī)定檢測鼠源病毒。

5．支原體檢查

按現(xiàn)行《中國藥典》生物制品無菌實(shí)驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。

6．無菌實(shí)驗(yàn)

按現(xiàn)行《中國藥典》生物制品無菌實(shí)驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。

（二）單克隆抗體的檢定

1．免疫球蛋白類及亞類

用免疫雙擴(kuò)散法或其它適宜的辦法測定。

2．親和力

用可靠、精確的辦法測定單克隆抗體（下列簡稱為單抗）的親和常數(shù)或相對親和力。普通狀況下，對于免疫原為可溶性的單抗，測其親和常數(shù)，對于免疫原為顆粒性抗原的單抗，測其相對親和力。

3．特異性

測定單抗對靶抗原的特異性；對多株單抗識別的抗原決定簇進(jìn)行有關(guān)性分析。

4．交叉反映

按附錄規(guī)定。

免疫組織化學(xué)法測定單抗與人體組織交叉反映，用冰凍及石蠟包埋的多個(gè)正常臟器組織測定。來源于腫瘤有關(guān)抗原的單抗應(yīng)進(jìn)行與多個(gè)腫瘤組織的交叉反映實(shí)驗(yàn)。

5．效價(jià)測定

用適宜辦法測定。

（三）其它原材料

1．細(xì)胞培養(yǎng)用小牛血清

支原體檢測應(yīng)為陰性。經(jīng)小量實(shí)驗(yàn)適于雜交瘤細(xì)胞生長。

2．培養(yǎng)液

應(yīng)有培養(yǎng)液來源，質(zhì)量指標(biāo)。

3．化學(xué)試劑

規(guī)格應(yīng)達(dá)成分析純以上。

二、基因工程抗體

參考《人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》和本指導(dǎo)原則中的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

三、細(xì)胞庫的建立

應(yīng)分別建立原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫的三級管理細(xì)胞庫，普通狀況下主細(xì)胞庫來自原始細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫來自主細(xì)胞庫。各級細(xì)胞庫應(yīng)有具體的制備過程、檢定狀況及管理規(guī)定等。

四、單抗生產(chǎn)

涉及用小鼠腹水法和細(xì)胞培養(yǎng)法制備。

（一）小鼠腹水法

1．小鼠

制備腹水必需使用合格的SPF級BACB/C小鼠或BACB/C和瑞士小鼠雜交子一代。

2．動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施

動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施應(yīng)有有關(guān)部門頒發(fā)的二級以上合格證。

3．腹水制備

取適量擴(kuò)增培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔制備腹水，小鼠能夠預(yù)先用液體石蠟或降植烷等解決。

（二）細(xì)胞培養(yǎng)法

能夠采用發(fā)酵罐培養(yǎng)，亦可用細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)收集上清液制備單克隆抗體。培養(yǎng)基用無牛血清或低牛血清培養(yǎng)基，不能用-內(nèi)酰胺類抗生素。

（三）抗體純化

可采用鹽析法、分子篩層析、離子交換親和層析等適宜的辦法。

1．盡量選用某些不引發(fā)免疫球蛋白聚合、變性等的純化辦法及條件。

2．應(yīng)驗(yàn)證所用的純化辦法能去除可能存在的非目的產(chǎn)物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、用于生產(chǎn)腹水抗體的刺激物、內(nèi)毒素、其它熱原質(zhì)、培養(yǎng)液成分或?qū)游鲋龀龀煞值取?/p>

3．應(yīng)驗(yàn)證所用的純化辦法能有效的去除/滅活病毒。

4．持續(xù)產(chǎn)生的各批產(chǎn)品必須符合質(zhì)檢規(guī)定，批間含有良好的重復(fù)性。

5．純化后解決

必要時(shí)對純化后抗體采用適宜辦法進(jìn)行解決。

（四）半成品、成品制備

五、檢定

涉及原液（小鼠腹水、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、純化抗體）、半成品及成品的檢定等。

（一）物理化學(xué)檢測

1．外觀

液體制劑應(yīng)為靠近無色微帶乳光的澄清液體，不應(yīng)含有異物、渾濁或搖不散的沉淀。

2．pH值

電位法測定

3．蛋白質(zhì)含量的測定

用Lowry法或其它適宜的辦法測定。

4．純度測定

（1）電泳法

用還原和非還原條件SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法。掃描后免疫球蛋白含量應(yīng)達(dá)成95%以上，二聚體≤10%。

（2）HPLC法

純度應(yīng)≥95%。

（3）多聚體測定

用FPLC或HPLC法，用適宜的分子篩層析，多聚體應(yīng)≤10%。

5．DNA含量測定

用DNA分子雜交法。每一劑量殘存鼠骨髓DNA含量不高于100pg。

6．水分

產(chǎn)品如為凍干制品，應(yīng)進(jìn)行殘存水分測定，其含量應(yīng)≤3%。

（二）生物學(xué)檢定

1．活性及效價(jià)測定

用適宜辦法進(jìn)行。

2．鼠源病毒檢定

同上鼠源病毒檢查。

3．無菌實(shí)驗(yàn)

同上無菌實(shí)驗(yàn)。

4．支原體檢定

同上支原體檢定。

5．安全實(shí)驗(yàn)

用小白鼠和豚鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

6．熱原質(zhì)實(shí)驗(yàn)

按照現(xiàn)行版《中國藥典》生物制品熱原質(zhì)實(shí)驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。采用家兔法時(shí)，家兔注射劑量=（人用劑量/50）*20*家兔體重（kg）。也可用鱟試劑法，1mg/mL蛋白濃度不應(yīng)檢測出有凝集活性。

7．異常毒性實(shí)驗(yàn)

（三）非免疫球蛋白雜質(zhì)分析

涉及來源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝的有關(guān)雜質(zhì)，采用適宜的技術(shù)和辦法進(jìn)行分析檢測。

六、經(jīng)修飾的單克隆抗體

為了提高單克隆抗體在治療和體內(nèi)診療中的作用，慣用單抗與毒素、藥品、放射性核素或其它物質(zhì)偶連形成免疫結(jié)合物，或在同一段多胎鏈包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重組蛋白來獲得。研究者除對前面提到的有關(guān)未偶連單克隆抗體（未修飾單克隆抗體）的規(guī)定外，還應(yīng)提供下列內(nèi)容：

（一）免疫結(jié)合物的構(gòu)建

應(yīng)提供構(gòu)建免疫結(jié)合物所用試劑和過程的具體資料，涉及：

1．描述與單克隆抗體連接的成分如：毒素、藥品、酶及細(xì)胞因子，涉及：全部成分的來源、構(gòu)造、制法、純度及特性。

2．制備免疫結(jié)合物所用化學(xué)試劑的描述，如連接劑和螯合劑。這些資料應(yīng)當(dāng)涉及試劑來源、制備辦法，以及合成或純化時(shí)殘留雜質(zhì)的測定等內(nèi)容。還應(yīng)提供合成反映途徑的圖解，以及與免疫結(jié)合物中所用化學(xué)試劑毒性有關(guān)資料。

3．在擬定成品的原則時(shí)應(yīng)首先擬定該原料與抗體的平均結(jié)合率及每個(gè)抗體被結(jié)合部分的數(shù)量，并揭示免疫球蛋白置換數(shù)量、效力和穩(wěn)定性間的關(guān)系。

4．用重組DNA技術(shù)制備的制品（如來源于轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或微生物培養(yǎng)基，嵌合的、易形的，互補(bǔ)決定區(qū)［CDR］接合的及單鏈Fv抗體，以及重組免疫結(jié)合物）應(yīng)提供構(gòu)建和置備過程的全部資料。重組免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性應(yīng)認(rèn)真研究。因聚合物形成構(gòu)形變化或變性而削弱了特異免疫反映性（如通過重組Fvs形成"雙抗"）可能造成藥代動力學(xué)的變化和/或與非靶組織結(jié)合。

（二）免疫結(jié)合物的純度

1．應(yīng)采用特殊方法確?？贵w盡量無外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因這些污染物質(zhì)在構(gòu)建免疫結(jié)合物過程中，能與核素、毒素或藥品發(fā)生反映。

2．應(yīng)規(guī)定最后產(chǎn)品中游離抗體或游離組分的限量。活性中間體應(yīng)被滅活或去除。

（三）免疫結(jié)合物的免疫反映性，效力及穩(wěn)定性

毒素或藥品偶聯(lián)至抗體上會變化其中任一成分的活性。

1．應(yīng)采用適宜的辦法；評定偶聯(lián)前后的免疫反映性。

2．免疫結(jié)合物非免疫球蛋白成分的活性應(yīng)在適宜的時(shí)候用效力實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行評定（例如，毒素、細(xì)胞因子或酶等），用于造影的放射性免疫結(jié)合物除外。

3．免疫結(jié)合物構(gòu)建后，應(yīng)擬定免疫反映性變化的百分率限值，并作為產(chǎn)品規(guī)格的構(gòu)成部分。

4．應(yīng)通過在合并的人血清中37℃無菌條件下孵育，來檢測免疫結(jié)合物在體外的穩(wěn)定性。如果所用抗凝劑不會影響免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性，血漿能夠用來替代血清。通過規(guī)定間隔時(shí)間分析樣品中完整免疫結(jié)合物及分解產(chǎn)物的濃度。應(yīng)具體闡明評定產(chǎn)品的穩(wěn)定性的條件及所用陰、陽對照。

（四）與放射性核素偶聯(lián)單克隆抗體的特殊問題

放免結(jié)合物應(yīng)用原則化的、嚴(yán)格控制并通過驗(yàn)證的辦法制備。應(yīng)建立檢測游離同位素、結(jié)合單克隆抗體、標(biāo)記的非免疫球蛋白物質(zhì)的放射性百分率的辦法。

1．放射性標(biāo)記單克隆抗體的初始研究用新藥申報(bào)包含持續(xù)3次放射標(biāo)記試生產(chǎn)的分析成果，應(yīng)證明所制備的產(chǎn)品未變化免疫特異性、無菌、無熱原質(zhì)。放射性標(biāo)記試生產(chǎn)應(yīng)由在研究中對單克隆抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記及使用試劑的同一組人員進(jìn)行。

2．制備免疫結(jié)合物時(shí)應(yīng)使用放射性藥品及同位素并應(yīng)提供其無菌及無熱原質(zhì)的分析證書及橫向參比的信涵。

3．在標(biāo)記試生產(chǎn)過程中，應(yīng)測定最后產(chǎn)品中共價(jià)結(jié)合的和游離的同位素的濃度，以及標(biāo)記試劑及其分解產(chǎn)物的殘留水平。

4．應(yīng)描述給每一種病人應(yīng)用前后進(jìn)行的質(zhì)控實(shí)驗(yàn)。

5．適宜的時(shí)候，應(yīng)檢測免疫結(jié)合物形成膠體的狀況，并對其進(jìn)行限定。

6．有關(guān)單抗制備中放射性標(biāo)記物的質(zhì)控原則參考國家有關(guān)放射性藥品規(guī)定。

七、產(chǎn)品穩(wěn)定性

產(chǎn)品穩(wěn)定性應(yīng)滿足臨床方案制訂的規(guī)定。加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)資料可作為產(chǎn)品審批及標(biāo)定用，但不能替代實(shí)際的穩(wěn)定性資料。

（一）應(yīng)制訂穩(wěn)定性檢定規(guī)劃，涉及在規(guī)定效期全過程中，每間隔一定時(shí)間進(jìn)行制品的物理化學(xué)完整性實(shí)驗(yàn)（如斷裂或聚合），效力實(shí)驗(yàn)，無菌實(shí)驗(yàn)，以及水分、pH和防腐劑的穩(wěn)定性測定。

（二）確保制品生物活性的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（例如定量體外效率實(shí)驗(yàn)）應(yīng)涉及廠內(nèi)參比品。如可能在實(shí)驗(yàn)的全過程中只使用一批實(shí)驗(yàn)抗原（如：純化的抗原、細(xì)胞或組織）。應(yīng)用定量效力實(shí)驗(yàn)使對生物活性進(jìn)行故意義的比較成為可能。

（三）加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，既將制品儲存在溫度高于常規(guī)儲存溫度后的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，可能有助于鑒定及建立穩(wěn)定性批示實(shí)驗(yàn)。表達(dá)穩(wěn)定性的特定參數(shù)應(yīng)通過對每一批制品用趨向分析辦法進(jìn)行監(jiān)測。

八、臨床前研究

由于生產(chǎn)條件或配方的變化可引發(fā)制品生物活性的明顯變化。因此，建議在臨床前研究中所使用的單抗應(yīng)與臨床實(shí)驗(yàn)中擬使用的單抗的生產(chǎn)工藝一致。

（一）交叉反映性實(shí)驗(yàn)

當(dāng)相似或有關(guān)抗原決定簇在人的非預(yù)定的細(xì)胞或靶組織體現(xiàn)時(shí)，可觀察到抗體與它們結(jié)合。非靶組織結(jié)合可能含有嚴(yán)重后果，特別是使用藥理活性抗體或細(xì)胞毒性免疫結(jié)合物時(shí)。因此，普通在Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)前應(yīng)通過用人組織或細(xì)胞進(jìn)行交叉反映性或非靶組織結(jié)合的實(shí)驗(yàn)室檢測。對于雙特異性抗體，除檢測雙特異性產(chǎn)品外，還應(yīng)對每株親本抗體進(jìn)行逐個(gè)評定。

1．檢測交叉反映性的體外實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)在，用人細(xì)胞或組織進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測，應(yīng)使用有效的并被確認(rèn)的新技術(shù)（參考1．2．4）。

2．測定交叉反映性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

當(dāng)有適宜模型時(shí)，單克隆抗體與非靶人組織的交叉反映性應(yīng)在動物中進(jìn)行一次綜合的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)成果，特別是對含有溶細(xì)胞性的免疫結(jié)合物或含有ADCC活性的抗體，普通規(guī)定進(jìn)行更廣泛的臨床前實(shí)驗(yàn)，涉及用一種以上動物超劑量及重復(fù)劑量進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮對非靶組織的定位。

（二）臨床前藥理學(xué)和毒性實(shí)驗(yàn)

1．設(shè)計(jì)單克隆抗體臨床前安全實(shí)驗(yàn)是為了預(yù)測在人體中可能的毒性

評定在人體中潛在不良反映副作用的可能性和嚴(yán)重程度，并可能擬定安全初始劑量和逐步提高劑量。有關(guān)單克隆抗體的臨床前實(shí)驗(yàn)，涉及免疫原性、穩(wěn)定性、組織交叉反映性和效應(yīng)功效。

2．動物毒理學(xué)研究

當(dāng)設(shè)計(jì)單克隆抗體的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮以下：

（1）若被試樣品為未偶聯(lián)抗體，且無適宜的動物模型或無攜帶有關(guān)抗原的動物，且與人組織交叉反映性實(shí)驗(yàn)明顯陰性，則毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)不是必須的。

（2）動物體內(nèi)有關(guān)抗原的性質(zhì)與人體內(nèi)有關(guān)抗原的生物學(xué)分布、功效及構(gòu)造應(yīng)含有可比性。但是，對于所用的動物模型，不必規(guī)定對單克隆抗體的抗原密度或親和力絕對相等。例如，結(jié)合力差別可通過增加劑量或服藥頻率來彌補(bǔ)。應(yīng)鑒定動物和人之間存在的抗原數(shù)，單克隆抗體的抗原親和力或?qū)慰寺】贵w結(jié)合的細(xì)胞應(yīng)答反映等方面存在的差別。這能夠更精確的推斷人用的安全初始劑量,并評定安全范疇。

（3）對單克隆抗體普通不規(guī)定進(jìn)行常規(guī)誘變性的評定。

（4）擬給育齡婦女重復(fù)或長久使用的產(chǎn)品，應(yīng)當(dāng)用適宜的動物模型進(jìn)行重復(fù)的進(jìn)一步的研究涉及致畸實(shí)驗(yàn)。

3．藥效學(xué)和動物藥代動力學(xué)

（1）當(dāng)有動物模型時(shí)，則應(yīng)盡量證明藥理學(xué)效應(yīng)與劑量的依賴性，以及有效劑量的范疇，能夠更加好地預(yù)測治療指數(shù)；當(dāng)無適合動物模型時(shí)，則應(yīng)盡量以人外周血、組織器官等進(jìn)行體外藥效學(xué)研究。當(dāng)有動物模型時(shí)，藥代動力學(xué)的有關(guān)資料（生物學(xué)分布，半衰期等）能夠從動物模型中得到；當(dāng)無適合動物模型時(shí)，動物藥代動力學(xué)能夠考慮不做，加強(qiáng)臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)藥代動力學(xué)方面的監(jiān)控。

（2）下列方面能夠指導(dǎo)藥代動力學(xué)幾藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)動物種類的選擇：

①最佳選擇與人有交叉反映或相似靶抗原的動物模型來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于僅抗人而未在動物模型中體現(xiàn)的人抗原或外源抗原（細(xì)菌，病毒等）的未偶聯(lián)單克隆抗體，能夠不必用缺少靶抗原的動物做實(shí)驗(yàn)。

②當(dāng)有抗原結(jié)合資料表明靈長類為最有關(guān)種屬時(shí)，則對未偶聯(lián)的單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)采用非人靈長類動物是適宜的。

③應(yīng)對使用正常嚙齒類動物和鼠異源移植模型精確預(yù)測單克隆抗體在人體的藥代動力學(xué)行為的可能性進(jìn)行嚴(yán)格評定。異源移植模型對評定單克隆抗體與人體內(nèi)腫瘤結(jié)合的能力更故意義。

（3）鼠源抗體對于小鼠為非免疫原性物質(zhì)，但在人體內(nèi)具免疫原性，這就使得在鼠內(nèi)所得的重復(fù)劑量成果難以推至擬在人體內(nèi)使用的重復(fù)劑量。使用完全人源的、嵌合的或"人源化的"單克隆抗體將出現(xiàn)對應(yīng)的問題，在這種狀況下用嚙齒類動物進(jìn)行重復(fù)劑量的研究意義不大。

4．用免疫結(jié)合物進(jìn)行的臨床體內(nèi)研究

（1）應(yīng)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性

①應(yīng)測定免疫結(jié)合物中每個(gè)組分在動物體內(nèi)藥代動力學(xué)和組織分布，并且與未偶聯(lián)抗體的分布相比較。

②不同組分的靶組織和他們能引發(fā)的潛在的毒性應(yīng)被證明。

（2）由于免疫結(jié)合物可能被降解或作用位點(diǎn)的活性不是單克隆抗體與靶抗原結(jié)合的成果，應(yīng)對含有放射性核素、毒素或藥品的免疫結(jié)合物進(jìn)行動物毒性實(shí)驗(yàn)，盡管該種動物不存在靶抗原。根據(jù)免疫結(jié)合物組分的性質(zhì)和其偶聯(lián)的穩(wěn)定性，對組分分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)是有道理的。應(yīng)充足描述每個(gè)組分的毒性狀況、副反映的發(fā)生和嚴(yán)重程度。所得成果應(yīng)與結(jié)合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)親密有關(guān)。如可能，應(yīng)用品有有關(guān)靶抗原或疾病模型動物體內(nèi)進(jìn)行免疫結(jié)合物實(shí)驗(yàn)，如果不存在靶抗原陽性動物就在嚙齒類動物體內(nèi)進(jìn)行。游離毒素或核素的毒性實(shí)驗(yàn)可在不同類動物中進(jìn)行。

（3）對于放射性核素的免疫結(jié)合物：

①動物生物分布的資料可被用于對初始人用劑量的評定。

②如可能，體現(xiàn)靶抗原的動物模型更有可能發(fā)現(xiàn)抗原"減少"或帶有在生物分布和/或毒性方面體現(xiàn)意外抗原的組織。

③異源移植模型能夠組織定位和抗原非特異放射性免疫結(jié)合物分布問題，但對擬定普通組織交叉反映范疇沒有協(xié)助。

④應(yīng)研究適宜的動物數(shù)量以用一種可接受的變異系數(shù)（普通不大于20%）對放射性劑量進(jìn)行評定。

⑤對于使用放射性總量的新陳代謝和測定從早到晚去除期時(shí)間點(diǎn)的適宜數(shù)值應(yīng)有完整計(jì)算