應用pcr及nesedpcr檢測柑桔木虱及其寄主九里香

應用pcr及nesedpcr檢測柑桔木虱及其寄主九里香

臍橙是世界上最具毀滅性的食品疾病。除中國以外，它還深受東南亞、南亞、非洲東南部和阿拉伯半島的影響。它是由難培養(yǎng)的韌皮部桿菌屬(Liberobacter)的一種細菌引起的。根據(jù)它的病原特性,可分為二個種:亞洲種(L.asiaticun)和非洲種(L.africanum),其傳播媒介分別為亞洲木虱(Diaphorinacitri)和非洲木虱(Triozaerytreae)。在我國,柑桔黃龍病已成為制約柑桔生產(chǎn)的主要病害。亞洲木虱的成蟲及高齡若蟲均可傳病,集團或單個木虱成蟲均能傳病。病原在木虱體內(nèi)循環(huán)期最短為1d,長的為27d。柑桔黃龍病的田間傳播和流行與木虱的帶菌及其活動有十分密切的關(guān)系,因此對木虱的研究亦成為黃龍病防治研究中的一個重要環(huán)節(jié)。以往對它的研究多采用飼菌木虱接種系列柑桔幼苗與電鏡觀察相結(jié)合的方法,費時且靈敏度較低。隨著PCR技術(shù)的興起,利用PCR技術(shù)可快速檢測和定量分析柑桔黃龍病及其病原的濃度,并利用NestedPCR進一步檢測尚未表現(xiàn)癥狀的黃龍病病株。NestedPCR的原理,即首先在常規(guī)條件下用第一套跨越目的DNA片段的引物擴增,接著對一部分反應物-產(chǎn)物混合物進行新的一輪擴增,采用的引物與第一套引物的產(chǎn)物內(nèi)側(cè)的序列配對。在此輪擴增中,只有目的產(chǎn)物繼續(xù)被擴增,其靈敏度可檢測到106基因組DNA背景下一個拷貝的病毒基因。作者對其稍做改動,先設計一套563bp的長引物(P1,P2),進行常規(guī)PCR擴增,再用一套介于563bp內(nèi)的短引物(P3,P4)進行第2次擴增,其效果亦十分理想。九里香(Murrayapanciculata)是蕓香科植物,是柑桔木虱的常見寄主。由于其植株葉片不表現(xiàn)柑桔黃龍病的斑駁病狀,且它的葉脈切片在電鏡下未能觀察到篩管細胞中有病原的存在。人們懷疑它可能是黃龍病病原寄主,但尚未找到直接依據(jù)。利用PCR技術(shù),特別結(jié)合NestedPCR的技術(shù),對木虱及九里香進行了詳細的研究,結(jié)果如下。1材料和方法1.1木銻的飼養(yǎng)及接種感病蘆柑植株:田間發(fā)病的黃龍病病株移栽在防蟲網(wǎng)室中,樹齡3年。健康木虱:田間木虱轉(zhuǎn)飼九里香實生苗,待卵孵化即轉(zhuǎn)入新九里香實生苗培養(yǎng)的木虱成蟲,即為健康木虱,因為黃龍病病原不會通過卵傳遞給新一代若蟲。健康木虱在蘆柑病株上飼菌1、2、3、5、10d,測定木虱獲得病原最短的飼菌天數(shù)。健康木虱在蘆柑病株上飼菌20d以上后,分別測定單蟲和不同數(shù)目的木虱的帶菌檢出率,以及轉(zhuǎn)飼接種1、2、3、5、7、10d的九里香實生苗,測定帶菌木虱能否將病原傳到九里香上及其最短的接種天數(shù)。同時,用帶菌木虱分別接種蘆柑實生苗1、3、5、7d,作為正對照。田間木虱:1999年初至10月間,在閩候窗下鄉(xiāng)遭受黃龍病嚴重危害的雪柑園(發(fā)病率50%以上)、福州城門鄉(xiāng)中等發(fā)病的柑桔園(發(fā)病率20%～50%)和輕病的柑桔園(發(fā)病率20%以下)分別采集的木虱成蟲樣本。同時,在福州市采集作為行人道觀賞植物的九里香樣本及其上的木虱樣本。1.2引物的設計與合成PCR試劑中各種試劑(Tag酶,10XPCRbuffer,dNTP)購自華美公司。引物P1(TCT-GITTTTCTTCGAGGTTGGTGA)、P2(ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG)是根據(jù)柑桔黃龍病病原亞洲株系的DNA序列(基因序號碼為94319)自行設計,既可用于常規(guī)PCR檢測,亦可用于NestedPCR的第1次擴增,而用于NestedPCR中第2次擴增的引物P3(GCGTTCAT-GTAGAAGTTGTG)、P4(CCTACAGGTGGCTGACTCAT)是引用Deng等的設計,兩對引物由上海生物工程公司合成。分子標記為SIGMA公司的產(chǎn)品,100bp分子量標記。PCR儀是PE公司的9600型,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3ss-pcr法檢測dna病原DNA的提純:方法為堿裂解法,并作部分改動。將木虱放入100μleppendorf管中,九里香葉脈0.5g剪碎后置于研缽內(nèi),加入50mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA(pH8.0),浸沒即可,磨爛后,14000r/min瞬間離心,取上清加入等體積0.2mol/LNaOH+1%SDS,搖勻,冰浴10min,加入等上清體積NaAc(pH4.8),搖勻,冰浴5min,14000r/min離心5min,取上清加入2～2.5倍無水酒精,-84℃30min,14000r/min離心20min,沉淀用75%、95%酒精各洗1次,吹干,DDW溶解。PCR與NestedPCR檢測:取0.4～1.0μgDNA,反應體積為50μl/管,在下列條件下進行PCR:94℃預變性2min,94℃變性30s,60℃退火1min,72℃延伸1min。反應35個循環(huán)后,72℃再延伸10min。首先用P1,P2進行第1次擴增,再取上述擴增產(chǎn)物5μl,用P3,P4再擴增1次。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖電泳,紫外燈下觀察并在凝膠成像儀下照相。2木錫木病檢測結(jié)果2.1PCR檢測采用PCR(引物為P1、P2)檢測不同數(shù)目的飼菌木虱的結(jié)果表明,2、3、5頭飼菌木虱在563bp處有明顯擴增帶,健康木虱和1頭飼菌木虱則均觀察不到擴增帶。2.2NestedPCR檢測NestedPCR檢測不同數(shù)目的飼菌木虱的結(jié)果表明,除健康木虱外,1、2、3、5頭飼菌木虱在400bp處有明顯擴增帶(圖1)。通過對100頭單個帶菌木虱進行檢測,共計擴增4次,單蟲帶菌檢出率為96%,說明NestedPCR有很高的重復性。在蘆柑病株上依次飼菌1、2、3、5、7d的單個木虱,檢測的結(jié)果均有擴增帶(圖2)。這與以前研究的結(jié)果一致,單個木虱在病株上飼菌1d便可獲得黃龍病病原。從閩候窗下鄉(xiāng)重病園、福州城門鄉(xiāng)中病園及附近輕病園采集的木虱各100頭,檢測其帶菌率依次為87%、53%、21%。這表明黃龍病在田間的傳播與木虱蟲口密度,特別是帶菌木虱的蟲口密度之間有十分密切的關(guān)系。檢測飼菌木虱接種九里香實生苗的結(jié)果表明,接種1、2、3、5、7、10d的九里香葉片均有擴增帶,而未接種的則沒有擴增帶(圖3)。同時,飼菌木虱接種蘆柑實生苗1、3、5、7d的正對照檢測結(jié)果表明,除健康蘆柑外,全部蘆柑葉片均有擴增帶(圖4)。這和以前研究的結(jié)果一致,單蟲在蘆柑上接種1d便可傳病。檢測城市九里香及其上的木虱的結(jié)果表明,城市九里香及其木虱樣本均有擴增帶,作為正對照的帶菌木虱接種的九里香實生苗和飼菌木虱樣本亦有擴增帶;而健康九里香實生苗和健康木虱則均無擴增帶。3面解漏檢的檢測近年來,隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,PCR技術(shù)也應用于研究柑桔黃龍病,但多運用在病原菌研究上。對木虱的研究仍局限在常規(guī)方法,既費時又欠準確。利用NestedPCR技術(shù)對柑桔木虱及其寄主九里香的研究,得出以下的初步結(jié)論。NestedPCR技術(shù)的靈敏度比PCR的高,可以檢測出末表現(xiàn)病狀的病株。本結(jié)果與Deng等的報道是一致的。由于未表現(xiàn)病狀的植株體內(nèi)的病原菌濃度比表現(xiàn)病狀的低,用PCR法檢測常會產(chǎn)生漏檢現(xiàn)象。用指示植物蘆柑的生物檢測法雖可解決漏檢問題,但甚為費時。因為黃龍病的潛伏期可長達10～15月。所以,長期以來對柑桔苗木實行檢疫的法律雖已公布,但因缺乏快速而準確的檢測方法,實際上無法執(zhí)行。NestedPCR技術(shù)的應用,將為柑桔苗木檢疫提供可行的檢測方法。NestedPCR克服了PCR難以檢測出單個帶菌木虱的困難,使對單個木虱的帶菌率進行分析成為可能。通過對100頭單個飼菌木虱的檢測,獲得其檢出陽性率可達96%的結(jié)果。從窗下鄉(xiāng)柑桔重病園(發(fā)病率為50%以上)、城門鄉(xiāng)中等病園(發(fā)病率為20%～50%)和輕病園(發(fā)病率為20%以下)采集木虱檢測的結(jié)果表明,木虱的帶菌率分別為87%、53%和21%。所以應用NestedPCR對田間木虱帶菌、寄主帶病及其環(huán)境條件等方面的研究,可進一步探索病害流行與測報的問題。九里香是木虱最喜歡的寄主,又是福建、廣東等省城鄉(xiāng)常種的觀賞植物。長期以來九里香是否為黃龍