葛根芩連湯配伍規(guī)律研究

葛根芩連湯配伍規(guī)律研究

中藥配藥理論是中醫(yī)學(xué)理論的精華之一?，F(xiàn)代對(duì)中藥配藥規(guī)律的研究對(duì)于繼承和發(fā)展中醫(yī)藥配藥理論具有重要的理論意義，同時(shí)也為新產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。這。葛根芩連湯為醫(yī)圣張仲景名方,出自《傷寒論·太陽(yáng)篇》,有解表清里、升清止利之功。本方由葛根、黃連、黃芩、甘草4味中藥組成,方中含多個(gè)常用藥對(duì)及常見配伍,并在方劑配伍中出現(xiàn)使用頻率最高的甘草,因此,選該方進(jìn)行配伍研究極具代表性。本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)對(duì)葛根芩連湯的不同配伍進(jìn)行化學(xué)、藥理方面的研究,從化學(xué)成分的變化與配伍、藥理效應(yīng)間的內(nèi)在聯(lián)系,闡明葛根芩連湯的配伍內(nèi)涵。1藥品、化學(xué)品、適應(yīng)證美國(guó)惠普HP1100高效液相色譜儀(紫外-可見光檢測(cè)器、二級(jí)管陣列檢測(cè)器),270A—HT型高效毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)AppliedBiosystem公司),未涂層融硅毛細(xì)管(62cm×50μm,有效長(zhǎng)度40cm)(河北永年銳灃色譜器件有限公司),pH計(jì)(美國(guó)ORION,410A型);甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純;葛根素、黃芩苷、小檗堿、甘草酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。埃希氏大腸桿菌(ATCC44113)、肺炎鏈球菌(ATCC31004)、金黃色葡萄球菌(ATCC26001)由本校微生物教研室提供,福氏2α志賀氏菌(ATCC51573)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。普通昆明種小鼠、Wistar大鼠、新西蘭兔由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。葛根、黃芩、黃連、甘草(蜜炙)藥材由廣東省藥材公司提供,由本校炮制教研室奚林明講師鑒定。2方法和結(jié)果2.1聯(lián)合用藥對(duì)黃甘草連湯的主要療效成分的影響2.1.1動(dòng)相、體積、流量色譜柱為ZorbaxODSC18柱(250mm×4mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸水溶液(48∶52);體積流量:1.0mL/min;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=15.8672X-4.5347,r=0.9999,線性范圍為12.04～96.32μg/mL。2.1.2柱溫2880色譜柱為ZorbaxSB-C18柱(250mm×4mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-乙腈-水(12∶8∶80);體積流量:1.0mL/min;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):250nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=38.7452X-2.1845,r=0.9999,線性范圍為10.01～160.16μg/mL。2.1.3乙酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜柱為ZorbaxSB-C18柱(150mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-0.2mol/L乙酸銨(0.01mol/LKH2PO4+0.2%三乙胺)(47∶53);體積流量:0.8mL/min;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):346nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=19.5689X-9.5649,r=0.9999,線性范圍為11.96～95.68μg/mL。2.1.4銨-冰醋酸柱溫色譜柱為Zorbax柱(250mm×4.6mm,10μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2mol/L醋酸銨-冰醋酸(67∶33∶1);體積流量:1.0mL/min;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):250nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=883.4925X-20.6502,r=0.9999,線性范圍為1.06～6.36μg/mL。2.1.5正交試驗(yàn)結(jié)果選葛根(因素A)、黃連(因素B)、黃芩(因素C)、甘草(因素D)作為4個(gè)因素,選用藥(+)和不用藥(-)為2個(gè)水平,并考慮兩兩交互作用的L16(216),因素水平見表1,正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。2.1.6粗濾去渣法提取根據(jù)《傷寒論》中葛根芩連湯的配比及煎煮特點(diǎn),葛根先煎20min,再加經(jīng)水浸泡30min的其他飲片共煎2次,每次30min,趁熱紗布粗濾去渣,混合兩次藥液,90℃水浴中定容至1000mL。取10mL,用70mL甲醇超聲提取30min,濾過,洗滌,用甲醇定容至100mL。精密吸取5mL,用流動(dòng)相定容于10mL量瓶中,備用。其余配伍組合均參照此法制備。2.1.7葛根連湯的主要成分是測(cè)定結(jié)果見表2。2.1.8不同配伍中黃秋葵的提取各配伍組合藥液放冷,離心,上清液用pH計(jì)測(cè)pH值。沉淀用水洗3次,60℃干燥至恒重,稱重。精確稱取約0.05g,加70%甲醇40mL超聲提取30min,濾過,洗滌3次,定容至50mL,精密吸取5mL,用流動(dòng)相定容于10mL量瓶中,測(cè)定,結(jié)果見表2?？梢姴煌湮橹?黃芩、黃連、甘草對(duì)葛根素,甘草對(duì)黃芩苷,葛根、黃芩對(duì)甘草酸的量沒有影響;而葛根、黃連對(duì)黃芩苷,葛根、黃芩、甘草對(duì)小檗堿,黃連對(duì)甘草酸的量均有降低作用;含黃連、黃芩的配伍煎液中產(chǎn)生的沉淀中含有大量的黃芩苷。各配伍煎液,除黃連外,pH值比單煎液在不同程度上降低。2.2聯(lián)合用藥對(duì)黃根蓮譜的影響2.2.1全方供試品溶液電解質(zhì)溶液由30mmol/L磷酸鹽和40mmol/L硼酸鹽組成;未涂層融硅毛細(xì)管(62cm×50μm,有效長(zhǎng)度40cm);分離電壓22kV;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;溫度30℃。取全方供試品溶液1份,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)定主要峰相對(duì)遷移時(shí)間和峰面積,結(jié)果表明各峰面積相對(duì)恒定,精密度試驗(yàn)的RSD<5%;全方供試品溶液分別在0、4、8、12、24h進(jìn)樣,測(cè)定主要峰相對(duì)遷移時(shí)間和峰面積,結(jié)果表明各峰面積相對(duì)恒定,穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD<5%;按處方配比制得全方供試品溶液5份,進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn),結(jié)果表明5批樣品的各峰遷移時(shí)間和峰面積相對(duì)恒定,RSD<5%。全方高效毛細(xì)管分離結(jié)果見圖1。2.2.2甘草、生生物酶分配取各配伍組合煎劑,按2.2.1項(xiàng)下方法測(cè)定,不同配伍中主要成分的相互影響結(jié)果見表3。可見黃連減小黃芩的q4峰和q5峰(黃芩苷)的峰面積,對(duì)黃芩q1、q2、q3峰沒有影響;葛根可減小黃芩苷的面積;甘草對(duì)黃芩q1、q2、q3、q4、q5(黃芩苷)影響不顯著;葛根、黃芩、甘草減小l2(小檗堿)峰面積;葛根、黃芩及兩者交互作用均能減小l5峰面積;甘草對(duì)黃連l1、l4、l5峰面積沒有影響;葛根、黃芩對(duì)l1、l4峰面積,葛根、黃芩的交互作用對(duì)l1、l2、l4峰面積,甘草與葛根、甘草與黃芩的交互作用對(duì)黃連l1、l2、l4、l5各峰面積均沒有顯著性影響。黃連、黃芩、甘草對(duì)葛根中g(shù)4(葛根素)峰面積沒有影響,葛根、黃芩、甘草使l2(小檗堿)峰面積減小,黃連、葛根使黃芩中q5(黃芩苷)峰面積減小,甘草對(duì)q5(黃芩苷)沒有顯著性差異,這與用HPLC測(cè)得的結(jié)果相一致。2.3聯(lián)合用藥對(duì)葛根蓮湯的藥理作用的影響2.3.1不同菌株對(duì)麻黃的體外抑菌活性選擇埃希氏大腸桿菌、肺炎鏈球菌、金黃葡萄菌和福氏2α志賀氏菌為研究對(duì)象,采用試管二倍稀釋法和平皿打孔法,以最低抑菌濃度和抑菌圈大小來衡量抑菌強(qiáng)弱,結(jié)果見表4?？梢?各配伍組合中,以黃連的體外抑菌活性最強(qiáng),其次是黃芩,不同的菌株強(qiáng)度有差異。炙甘草對(duì)金黃葡萄球菌與福氏2α志賀氏菌有弱的抑菌活性,葛根對(duì)金黃色葡萄球菌有弱的抑菌活性,在與黃連配伍中,其余3藥均起拮抗作用。其中對(duì)埃希氏大腸腸桿菌作用中,炙甘草對(duì)黃連的拮抗作用強(qiáng)于葛根,炙甘草亦拮抗黃芩,葛根則無明顯影響;對(duì)肺炎鏈球菌的作用中,對(duì)黃連的拮抗作用炙甘草強(qiáng)于葛根,而炙甘草、葛根對(duì)黃芩均無明顯影響;對(duì)福氏2α志賀氏菌的影響中,對(duì)黃連拮抗作用,黃芩強(qiáng)于葛根與炙甘草。炙甘草對(duì)黃芩有拮抗作用,葛根則對(duì)黃芩無明顯作用。對(duì)金黃色葡萄球菌中,葛根與炙甘草對(duì)黃芩無明顯影響;葛根與炙甘草呈加合作用。2.3.2不同配伍小鼠的生理反應(yīng)取正常小鼠給不同配伍組合藥物后以墨汁灌胃,觀察墨汁在體內(nèi)的小腸推進(jìn)率;以番瀉葉煎劑制造腹瀉模型小鼠,以腹瀉指數(shù)為指標(biāo)觀察給不同配伍組小鼠的生理反應(yīng),結(jié)果見表5,6?？梢?在墨汁小腸推進(jìn)率的試驗(yàn)中,以黃連與炙甘草的作用為主,葛根與黃芩均拮抗黃連的作用,炙甘草增強(qiáng)黃連的作用;對(duì)腹瀉小鼠腹瀉指數(shù)的影響,起主要作用的為黃連,而葛根與炙甘草能增強(qiáng)黃連作用,黃芩拮抗黃連。2.3.3保乳反應(yīng)指數(shù)最大體溫反應(yīng)高度以皮下注射埃希氏大腸桿菌懸浮液制造發(fā)熱大鼠模型,然后ig不同配伍組合的藥物,測(cè)量體溫(肛溫),觀察不同配伍對(duì)大鼠的影響,并觀測(cè)6h體溫反應(yīng)指數(shù)最大體溫反應(yīng)高度,結(jié)果見表7,8?？梢?對(duì)于6h體溫反應(yīng)指數(shù),黃芩有明顯降低該指標(biāo)的作用,而黃連、炙甘草對(duì)其有明顯的拮抗作用,葛根對(duì)黃芩有增強(qiáng)的作用。黃連不利于該指標(biāo)的改善,炙甘草對(duì)葛根、黃連均有拮抗作用。對(duì)平均最大體溫反應(yīng)高度指標(biāo),與黃芩配伍,黃連、炙甘草均表現(xiàn)為拮抗作用,而葛根則表現(xiàn)為增強(qiáng)黃芩的作用。2.3.4不同配伍的影響將健康新西蘭兔接種福氏2α志賀氏菌以制造菌痢模型,ig不同配伍組合藥物,連續(xù)3d,然后處死,進(jìn)行尸檢。以結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌定量記數(shù)、結(jié)腸組織內(nèi)細(xì)菌定量記數(shù)、結(jié)腸炎指數(shù)為指標(biāo)考察不同配伍的影響。結(jié)果見表9～11?？梢?對(duì)于結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌定量記數(shù)指標(biāo),黃連、黃芩均能明顯減少腸內(nèi)容物細(xì)菌的記數(shù),葛根與甘草則作用不明顯。黃芩拮抗黃連的作用,葛根、炙甘草對(duì)黃連、黃芩的作用均無明顯影響。對(duì)于結(jié)腸組織內(nèi)細(xì)菌定量記數(shù)指標(biāo),同樣以黃連、黃芩的作用最明顯,葛根、炙甘草無明顯作用。黃芩與黃連配伍后互相拮抗,但當(dāng)炙甘草、葛根與黃芩、黃連藥對(duì)配伍時(shí),兩者拮抗作用消失。葛根、炙甘草對(duì)黃芩或黃連則無明顯作用。從結(jié)腸炎指數(shù)指標(biāo)來看,炙甘草則可以明顯降低結(jié)腸炎指數(shù),而葛根、黃芩、黃連則作用不明顯,它們對(duì)炙甘草的作用也無明顯影響。3葛根類藥物的熱效應(yīng)3.1從不同配伍中4個(gè)有效成分測(cè)定結(jié)果可見,各配伍中葛根素的量變化無顯著性差異;黃芩苷、小檗堿、甘草酸的量以各單味藥單煎液的量最高,全方的3種成分分別占單煎液的67%、59%、70%。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各藥配伍組合中,以黃連的體內(nèi)外抑菌活性最強(qiáng),不同的菌株強(qiáng)度有差異;解熱試驗(yàn)中,最佳組合為葛根黃芩;在抗腹瀉試驗(yàn)中,最佳組合為黃連炙甘草。從化學(xué)成分和藥理指標(biāo)研究結(jié)果綜合分析可知,葛根與黃芩配伍中具有解熱作用的葛根素、黃芩苷的量分別為最高和次高,兩藥具有協(xié)同作用,在各配伍組中解熱效果最佳;黃連單煎液中小檗堿的量比其他配伍組均高,在抑菌指標(biāo)上作用最強(qiáng);黃連與甘草配伍,小檗堿、甘草酸的量?jī)H比單煎液低,而抗腹瀉作用、體內(nèi)抑菌、降低結(jié)腸炎指數(shù)方面仍以黃連甘草為主;但全方同時(shí)所具有的解熱、體內(nèi)外抑菌、抗腹瀉等作用,是各單味藥及其他配伍組所不具備的,所以從治療“協(xié)