專題基因工程模板

資料內(nèi)容僅供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯(lián)系改正或者刪除。專題1基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設計,經(jīng)過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術,賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃贒NA分子水平上進行設計和施工的,又叫做DNA重組技術。(一)基因工程的基本工具1.”分子手術刀”——限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)(1)來源:主要是從原核生物中分離純化出來的。(2)功能:能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列,而且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開,因此具有專一性。(3)結(jié)果:經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端一般有兩種形式:黏性末端和平末端。2.”分子縫合針”——DNA連接酶(1)兩種DNA連接酶(E?coliDNA連接酶和T4-DNA連接酶)的比較:①相同點:都縫合磷酸二酯鍵。②區(qū)別:E?coliDNA連接酶來源于T4噬菌體,只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來;而T4DNA連接酶能縫合兩種末端,但連接平末端的之間的效率較低。(2)與DNA聚合酶作用的異同:??????????????????????DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個DNA片段的末端,形成磷酸二酯鍵。3.”分子運輸車”——載體(1)載體具備的條件:①能在受體細胞中復制并穩(wěn)定保存。②具有一至多個限制酶切點,供外源DNA片段插入。③具有標記基因,供重組DNA的鑒定和選擇。(2)最常見的載體是??質(zhì)粒,它是一種裸露的、結(jié)構簡單的、獨立于細菌染色體之外,并具有自我復制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。(3)其它載體:噬菌體的衍生物、動植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的獲取1.目的基因是指:編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構基因。2.原核基因采取直接分離獲得,真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常見方法有反轉(zhuǎn)錄法_和化學合成法_。3.PCR技術擴增目的基因(1)原理:DNA雙鏈復制(2)過程:第一步:加熱至90～95℃DNA解鏈;第二步:冷卻到55～60℃,引物結(jié)合到互補DNA鏈;第三步:加熱至70～75℃,熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。第二步:基因表示載體的構建1.目的:使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,而且能夠遺傳至下一代,使目的基因能夠表示和發(fā)揮作用。2.組成:目的基因＋啟動子＋終止子＋標記基因(1)啟動子:是一段有特殊結(jié)構的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,最終獲得所需的蛋白質(zhì)。(2)終止子:也是一段有特殊結(jié)構的DNA片段,位于基因的尾端。(3)標記基因的作用:是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因,從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常見的標記基因是抗生素基因。第三步:將目的基因?qū)胧荏w細胞_1.轉(zhuǎn)化的概念:是目的基因進入受體細胞內(nèi),而且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表示的過程。2.常見的轉(zhuǎn)化方法:將目的基因?qū)胫参锛毎?采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,其次還有基因槍法和花粉管通道法等。將目的基因?qū)雱游锛毎?最常見的方法是顯微注射技術。此方法的受體細胞多是受精卵。將目的基因?qū)胛⑸锛毎?原核生物作為受體細胞的原因是繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少,最常見的原核細胞是大腸桿菌,其轉(zhuǎn)化方法是:先用Ca2+處理細胞,使其成為感受態(tài)細胞,再將重組表示載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程。3.重組細胞導入受體細胞后,篩選含有基因表示載體受體細胞的依據(jù)是標記基因是否表示。第四步:目的基因的檢測和表示1.首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子雜交技術。2.其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,方法是采用用標記的目的基因作探針與mRNA雜交。3.最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì),用相應的抗體進行抗原－抗體雜交。4.有時還需進行個體生物學水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。(三)基因工程的應用1.植物基因工程:抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物,利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。2.動物基因工程:提高動物生長速度、改進畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物。3.基因治療:把正常的外源基因?qū)氩∪梭w內(nèi),使該基因表示產(chǎn)物發(fā)揮作用。(四)蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構規(guī)律及其生物功能的關系作為基礎,經(jīng)過基因修飾或基因合成,對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造,或制造一種新的蛋白質(zhì),以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。(基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)錄翻譯專題2細胞工程(一)植物細胞工程1.理論基礎(原理):細胞全能性全能性表示的難易程度:受精卵＞生殖細胞＞干細胞＞體細胞;植物細胞＞動物細胞2.植物組織培養(yǎng)技術(1)過程:離體的植物器官、組織或細胞―→愈傷組織―→試管苗―→植物體(2)用途:微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。(3)地位:是培育轉(zhuǎn)基因植物、植物體細胞雜交培育植物新品種的最后一道工序。3.植物體細胞雜交技術(1)過程:(2)誘導融合的方法:物理法包括離心、振動、電刺激等。化學法一般是用聚乙二醇(PEG)作為誘導劑。(3)意義:克服了遠緣雜交不親和的障礙。(二)動物細胞工程1.動物細胞培養(yǎng)(1)概念:動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體中取出相關的組織,將它分散成單個細胞,然后放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和繁殖。(2)動物細胞培養(yǎng)的流程:取動物組織塊(動物胚胎或幼齡動物的器官或組織)→剪碎→用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞→制成細胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。(3)細胞貼壁和接觸抑制:懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上,稱為細胞貼壁。細胞數(shù)目不斷增多,當貼壁細胞分裂生長到表面相互抑制時,細胞就會停止分裂增殖,這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。(4)動物細胞培養(yǎng)需要滿足以下條件①無菌、無毒的環(huán)境:培養(yǎng)液應進行無菌處理。一般還要在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素,以防培養(yǎng)過程中的污染。另外,應定期更換培養(yǎng)液,防止代謝產(chǎn)物積累對細胞自身造成危害。②營養(yǎng):合成培養(yǎng)基成分:糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。一般需加入血清、血漿等天然成分。③溫度:適宜溫度:哺乳動物多是36.5℃＋0.5℃;pH:7.2～7.4。④氣體環(huán)境:95%空氣＋5%CO2。O2是細胞代謝所必須的,CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH。(5)動物細胞培養(yǎng)技術的應用:制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測有毒物質(zhì)、培養(yǎng)醫(yī)學研究的各種細胞。2.動物體細胞核移植技術和克隆動物(1)哺乳動物核移植能夠分為胚胎細胞核移植(比較容易)和體細胞核移植(比較難)。(2)選用去核卵(母)細胞的原因:卵(母)細胞比較大,容易操作;卵(母)細胞細胞質(zhì)多,營養(yǎng)豐富。(3)體細胞核移植的大致過程是:(右圖)核移植胚胎移植(4)體細胞核移植技術的應用:①加速家畜遺傳改良進程,促進良畜群繁育;②保護瀕危物種,增大存活數(shù)量;③生產(chǎn)珍貴的醫(yī)用蛋白;④作為異種移植的供體;⑤用于組織器官的移植等。(5)體細胞核移植技術存在的問題:克隆動物存在著健康問題、表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷等。3.動物細胞融合(1)動物細胞融合也稱細胞雜交,是指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞,稱為雜交細胞。(2)動物細胞融合與植物原生質(zhì)體融合的原理基本相同,誘導動物細胞融合的方法與植物原生質(zhì)體融合的方法類似,常見的誘導因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。(3)動物細胞融合的意義:克服了遠緣雜交的不親和性,成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段。(4)動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較:比較項目細胞融合的原理細胞融合的方法誘導手段用法植物體細胞雜交細胞膜的流動性去除細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合離心、電刺激、振動,聚乙二醇等試劑誘導克服了遠緣雜交的不親和性,獲得雜種植株動物細胞融合細胞膜的流動性使細胞分散后誘導細胞融合除應用植物細胞雜交手段外,再加滅活的病毒誘導制備單克隆抗體的技術之一4.單克隆抗體(1)抗體:一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差。(2)單克隆抗體的制備過程(3)雜交瘤細胞的特點:既能大量繁殖,又能產(chǎn)生專一的抗體。(4)單克隆抗體的優(yōu)點:特異性強,靈敏度高,并能大量制備。(5)單克隆抗體的作用:①作為診斷試劑:準確識別各種抗原物質(zhì)的細微差異,并跟一定抗原發(fā)生特異性結(jié)合,具有準確、高效、簡易、快速的優(yōu)點。②用于治療疾病和運載藥物:主要用于治療癌癥治療,可制成”生物導彈”,也有少量用于治療其它疾病。專題3胚胎工程(一)動物胚胎發(fā)育的基本過程1、胚胎工程是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術,如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養(yǎng)等技術。經(jīng)過處理后獲得的胚胎,還需移植到雌性動物體內(nèi)生產(chǎn)后代,以滿足人類的各種需求。2、動物胚胎發(fā)育的基本過程(1)受精場所是母體的輸卵管上段。(2)卵裂期:特點:細胞有絲分裂,細胞數(shù)量不斷增加,但胚胎的總體體積并不增加,或略有減小。(3)桑椹胚:特點:胚胎細胞數(shù)目達到32個左右時,胚胎形成致密的細胞團,形似桑椹。是全能細胞。(4)囊胚:特點:細胞開始出現(xiàn)分化(該時期細胞的全能性仍比較高)。聚集在胚胎一端個體較大的細胞稱為內(nèi)細胞團,將來發(fā)育成胎兒的各種組織。中間的空腔稱為囊胚腔。(5)原腸胚:特點:有了三胚層的分化,具有囊胚腔和原腸腔。(二)胚胎干細胞1、哺乳動物的胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞,來源于早期胚胎或從原始性腺中分離出來。2、具有胚胎細胞的特性,在形態(tài)上表現(xiàn)為體積小,細胞核大,核仁明顯;在功能上,具有發(fā)育的全能性,可分化為成年動物體內(nèi)任何一種組織細胞。另外,在體外培養(yǎng)的條件下,能夠增殖而不發(fā)生分化,可進行冷凍保存,也可進行遺傳改造。3、胚胎干細胞的主要用途是:①可用于研究哺乳動物個體發(fā)生和發(fā)育規(guī)律;②是在體外條件下研究細胞分化的理想材料,在培養(yǎng)液中加入分化誘導因子,如牛黃酸等化學物質(zhì)時,就能夠誘導ES細胞向不同類型的組織細胞分化,這為揭示細胞分化和細胞凋亡的機理提供了有效的手段;③能夠用于治療人類的某些頑疾,如帕金森綜合癥、少年糖尿病等;④利用能夠被誘導分化形成新的組織細胞的特性,移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復并恢復正常功能;⑤隨著組織工程技術的發(fā)展,經(jīng)過ES細胞體外誘導分化,定向培育出人造組織器官,用于器官移植,解決供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題。(三)胚胎工程的應用1.體外受精和胚胎的早期培養(yǎng)(1)卵母細胞的采集和培養(yǎng):主要方法:用促性腺激素處理,使其排出更多的卵子,然后,從輸卵管中沖取卵子,直接與獲能的精子在體外受精。第二種方法:從剛屠宰母畜的卵巢中采集卵母細胞;第三種方法是借助超聲波探測儀、腹腔鏡等直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。采集的卵母細胞,都要在體外經(jīng)人工培養(yǎng)成熟后,才能與獲能的精子受精。(2)精子的采集和獲能:在體外受精前,要對精子進行獲能處理。(3)受精:獲能的精子和培養(yǎng)成熟的卵細胞在獲能溶液或?qū)Ｓ玫氖芫芤褐型瓿墒芫^程。(4)胚胎的早期培養(yǎng):精子與卵子在體外受精后,應將受精卵移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育能力。培養(yǎng)液成分較復雜,除一些無機鹽和有機鹽外,還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)成分,以及血清等物質(zhì)。當胚胎發(fā)育到適宜的階段時,可將其取出向受體移植或冷凍保存。不同動物胚胎移植的時間不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚階段才能進行移植,小鼠、家兔等實驗動物可在更早的階段移植,人的體外受精胚胎可在8~16個細胞階段移植。)2.胚胎移植(1)胚胎移植是指將雌性動物的早期胚胎,或者經(jīng)過體外受精及其它方式得到的胚胎,移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其它雌性動物的體內(nèi),使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術。其中提供胚胎的個體稱為”供體”,接受胚胎的個體稱為”受體”。(供體為優(yōu)良品種,作為受體的雌性動物應為常見或存量大的品種。)地位:如轉(zhuǎn)基因、核移植,或體外受精等任何一項胚胎工程技術所生產(chǎn)的胚胎,都必須經(jīng)過胚胎移植技術才能獲得后代,是胚胎工程的最后一道”工序”。(2)胚胎移植的意義:大大縮短了供體本身的繁殖周期,充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁殖能力。(3)生理學基礎:①動物發(fā)情排卵后,同種動物的供、受體生殖器官的生理變化是相同的。這就為供體的胚胎移入受體提供了相同的生理環(huán)境。②早期胚胎在一定時間內(nèi)處于游離狀態(tài)。這就為胚胎的收集提供了可能。③受體對移入子宮的外來胚胎不發(fā)生免疫排斥反應。這為胚胎在受體的存活提供了可能。④供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯(lián)系,但供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受影響。(4)基本程序主要包括:①對供、受體的選擇和處理。選擇遺傳特性和生產(chǎn)性能優(yōu)秀的供體,有健康的體質(zhì)和正常繁殖能力的受體,供體和受體是同一物種。并用激素進行同期發(fā)情處理,用促性腺激素對供體母牛做超數(shù)排卵處理。②配種或人工授精。③對胚胎的收集、檢查、培養(yǎng)或保存。配種或輸精后第7天,用特制的沖卵裝置,把供體母牛子宮內(nèi)的胚胎沖洗出來(也叫沖卵)。對胚胎進行質(zhì)量檢查,此時的胚胎應發(fā)育到桑椹或胚囊胚階段。直接向受體移植或放入－196℃的液氮中保存。④對胚胎進行移植。⑤移植后的檢查。對受體母牛進行是否妊娠的檢查。3.胚胎分割(1)概念:是指采用機械方法將早期胚胎切割2等份、4等份等,經(jīng)移植獲得同卵雙胎或多胎的技術。(2)意義:來自同一胚胎的后代具有相同的遺傳物質(zhì),屬于無性繁殖。(3)材料:發(fā)育良好,形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚。(桑椹胚至囊胚的發(fā)育過程中,細胞開始分化,但其全能性仍很高,也可用于胚胎分割。)(4)操作過程:對囊胚階段的胚胎分割時,要將內(nèi)細胞團均等分割,否則會影響分割后胚胎的恢復和進一步發(fā)育。專題4生物技術的安全性和倫理問題(一)轉(zhuǎn)基因生物的安全性爭論:(1)基因生物與食物安全:反方觀點:反對”實質(zhì)性等同”、出現(xiàn)滯后效應、出現(xiàn)新的過敏原、營養(yǎng)成分改變正方觀點:有安全性評價、科學家負責的態(tài)度、無實例無證據(jù)(2)轉(zhuǎn)基因生物與生物安全:對生物多樣性的影響反方觀點:擴散到種植區(qū)之外變成野生種類、成為入侵外來物種、重組出有害的病原體、成為超級雜草、有可能造成”基因污染”正方觀點:生命力有限、存在生殖隔離、花粉傳播距離有限、花粉存活時間有限(3)轉(zhuǎn)基因生物與環(huán)境安全:對生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響反方觀點:打破物種界限、二次污染、重組出有害的病原微生物、