酮康唑傳遞體的制備及其在經皮滲透中的應用

酮康唑傳遞體的制備及其在經皮滲透中的應用

采用transferu方法，又名柔性納米脂質體，是一種新型的皮膚透皮劑。將各種表面活性劑添加到聚脂材料中，高度變形，能有效滲透比自身小的皮膚孔，達到聚脂母材料的目的。將藥物制成傳遞體透皮制劑,具有可制備藥品種類多、透過率高、使用方便、起效快等優(yōu)點。目前國內外TF的研究主要集中于干擾素、胰島素等大分子藥物的研究,而低分子藥物研究則少見。本研究探討了制備KCZTF的可行性,并初步確定了其含量測定方法及體外透皮吸收效果,為KCZTF的進一步研究打下基礎。1儀器和試劑1.1試劑:四氟總膽固醇-四氟總膽固醇酮康唑(南京制藥二廠,批號20000603),酮康唑對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號0294-9801),注射用大豆磷脂(上海浦江磷脂有限公司,批號20010227),膽酸鈉(中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司,批號20001227),膽固醇(中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司,批號20010108),SephadexG-50(上海腦海生物科技公司),甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。1.2儀器、設備和儀器H-800型透射電鏡(日本Hitachi公司),高效液相色譜儀(WATERS2695-2696,美國),旋轉蒸發(fā)器(RE-52A,上海亞榮生化儀器廠),AS2060B超聲波粉碎機(美國AutoScience),TG328B分析天平(中國湖南湘儀廠),pHs-3C酸度計(上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠),改良的Franz擴散池(自制),UV-2201紫外可見分光光度計(日本島津),電子恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。1.3動物家兔,體重1.5～2.0kg(昆明生物制藥廠實驗動物中心,合格證號:滇動字第2002066號)。2方法和結果2.1kczfs的制備油相:稱取一定的量注射用大豆磷脂和膽固醇(約占處方量的15%,w/w)、維生素E(占處方量5%)溶于適量氯仿-甲醇混合溶媒中(氯仿:甲醇體積比1:2),置于圓底燒瓶中,于37℃水浴中減壓旋轉蒸發(fā)除去氯仿,使磷脂等成膜材料在燒瓶壁形成均勻類脂薄膜;水相:取磷酸鹽緩沖溶液(pH5.8)適量,加入KCZ(約0.2g)和膽酸鈉(處方量2.0%)攪拌溶解;將水相緩緩加入油相中,于水浴中旋轉蒸發(fā),直到形成透明的均勻乳白色溶液;再取0.9%NaCl水合介質旋轉洗膜lh左右,直到形成澄清而透明的乳白色溶液;將所得混懸液在冰浴條件下經超聲波粉碎機處理3次,每次2min,間隔30s;再經0.15μm微孔濾膜加壓(0.5mPa)濾過,即可制得KCZTF。KCZ普通脂質體的制備方法同上,只是水相中不含膽酸鈉。2.2質量控制2.2.1kczrt平均粒徑的計算取樣品適量,稀釋,用1%磷鉬酸負染色,在透射電鏡下(15萬倍)觀察,KCZTF和KCZ普通脂質體均呈圓形或橢圓形。粒度范圍在50～250nm之間,轉換視野觀察600個不同微粒,50～100nm占24.67%,100～150nm占43.52%,150～200nm占23.55%,200～250nm占8.26%,按公式Dv=()1/3(式中f=頻數(shù),d1=體積徑,取每組段中值)計算得到制備的KCZTF平均粒徑Dv=146.70nm;KCZ普通脂質體粒徑≤150nm,平均粒徑Dv=133.24nm。2.2.2hplc-fs法測定了含量2.2.2.流動相、柱溫固定相:SpherisorbC18(10μm)柱;流動相:甲醇-水(80:20內含0.05%三乙胺),流速1.OmL/min;檢測波長244nm;柱溫:室溫;進樣體積為20μL。2.2.2.對照品溶液的測定精密稱取一定量的酮康唑對照品,用流動相配制成濃度分別為15、30、45、60、75、90μg/mL的對照品溶液,各進樣20μL,按上述色譜條件測定峰面積,以酮康唑溶液濃度(C)對峰面積(A)作圖,得回歸方程:C=6.3596×10-5A+1.3324,r=0.9999。表明酮康唑含量在15～90μg/mL范圍內線性關系良好。2.2.2.流動相的加入精密移取10μLTF于1OmL容量瓶中,加入流動相,振搖,定容。取10μL注入HPLC,記錄峰面積,代入回歸方程得樣品中KCZ的含量。2.2.2.加樣回收及加樣回收取酮康唑傳遞體溶液適量,精密加入處方量酮康唑對照品制備成適當濃度溶液,依含量測定方法測定,計算回收率,得平均加樣回收率102.67%,RSD0.80%。2.2.2.日內差測定取含量分別為15、45、75樣品溶液于同日內每隔2h測定含量1次,計算日內差;每日測定含量1次,連續(xù)進行3d,計算日間差,結果顯示日間和日內RSD均小于2.0%。2.2.2.洗脫液收集精密量取KCZTF1mL上SephadexG-50柱(300mm×10mm),以流動相洗脫,流速約1.OmL/min,收集洗脫液1mL/份。依含量測定方法分別測定游離藥物量(Wy)和TF總藥量(Wz),按式ER%=[(Wz-Wy)/Wz]×100%,測得TF的平均包封率為(53.48±1.86)%(n=6);采用相同方法得到普通脂質體的平均包封率為(36.53±1.53)%(n=6)。2.2.3外觀性狀測定參照《中國藥典》的相關原則進行。溫度實驗:精密量取一定量樣品,密閉于棕色玻璃瓶中,于0、25、40、60℃恒溫干燥箱中放置10d,于第5、10天分別取出觀察外觀性狀并測定含量。光照實驗:精密量取一定量樣品密閉于無色玻璃瓶中(25℃),于4000LX光照10d,第5、10天觀察外觀性狀并測定含量,見表1。2.2.4m微孔濾膜的表征考察在外力作用下(0.1～0.5mPa),TF混懸液變形通過0.15μm微孔濾膜的性能。分別記錄5mL水、TF和普通脂質體通過濾膜的時間,按P=(tTF/t水)×100%計算相對速率,每個壓力組做6次,見表2。經t檢驗,P=0.000<0.01,顯示TF與普通脂質體具有極顯著差異。2.3離體透皮試驗2.3.1kcz在接收池中測量條件的確定2.3.1.測定波長的確定取干燥至恒重的KCZ對照品25.00mg,置于100mL容量瓶,加生理鹽水(pH1.5)定容于100mL容量瓶中,對制備的酮康唑溶液(生理鹽水為空白對照)進行掃描,發(fā)現(xiàn)在268.5nm波長處,輔料和溶媒對KCZ測定無干擾,因此確定268.5nm為測定波長。2.3.1.加樣回收率試驗①回收率實驗:在卵磷脂、VitE和膽固醇飽和的生理鹽水中,加入處方量的膽酸鈉,然后精密加入不同量的KCZ對照品,按上法測定KCZ的含量,得到平均加樣回收率97.32%,RSD在2.0%以下;②重現(xiàn)性實驗:取回收率實驗各含量的貯備液于同日內每隔2h測定含量1次,計算日內差;每日測定含量1次,連續(xù)進行3d,計算日間差,結果顯示日間和日內RSD均小于3.0%。2.3.1.標準回歸方程取干燥至恒重的酮康唑25.00mg,置于100mL容量瓶中,分別取1、2、3、4、5、6mL定容于容量瓶中,于268.5nm波長分別測定吸收值,UV-2201自動模擬出標準回歸方程:A=2.5429×C+0.0022,r2=0.9997。2.3.2去皮、去毛、制備取體重1.5～2.0kg家兔,背部皮膚用脫毛劑脫毛,水洗凈皮膚表面,飼養(yǎng)1h,選取皮膚表面目測無破損的兔子處死取皮,去除皮下脂肪組織,用蒸餾水反復洗凈,再用生理鹽水漂洗后,置生理鹽水中冷藏備用。2.3.3kcz的釋放液配制將25.00mgKCZ加生理鹽水(pH1.5)定溶于100mL容量瓶中,除0%組只含釋放液,用生理鹽水(pH1.5)透皮后的接受液為空白之外,其它各組配成含3%DP和3%AZ的KCZ作為釋放液,以相應濃度的不含KCZ的透過液為空白對照。2.3.4水浴加熱水浴加熱水浴液樣品制備將兔皮固定于改良的franz擴散池(直徑2.3cm,面積4.15cm2,接收容積15mL),角質層向上,釋放液2mL,接收池以生理鹽水(pH1.5)為接收液,并保持釋放液與兔皮接觸,將franz擴散池置于恒溫水浴上,并保持溫度(37.0±0.5)℃,分別于2、4、6、8、10、12、24h取樣1.OmL,同時補充等體積的生理鹽水。1.OmL樣品置于10mL容量瓶中,用生理鹽水稀釋至刻度,于268.5nm波長處測定紫外吸收度(空白對照按相同方法處理),根據(jù)回歸方程,計算透過量。2.3.5透皮吸收量計算將每次測得的吸收度代入紫外標準曲線方程計算濃度,根據(jù)公式:N=Ct·V·10+V0·∑Ct-1,計算累積透皮吸收量,從而得出不同時間面積KCZ溶液的累積透皮吸收量(Ct:t時刻的濃度計算值;V:接受液的總體積;V0:每次取樣體積),結果見表3。2.3.6累積透皮百分率根據(jù)不同時間KCZ溶液的累積透皮吸收量(Nt),按公式:Q=Nt/S·100%計算KCZ的累積透皮百分率(%)。(N,:t時刻累積透皮量,包括每次取藥損失量;S:釋放池初始藥物的量),結果見表4。2.3.7kcz原料和kcz-dp原料的dp和az-dp的比較(累積透皮百分率,t檢驗)傳遞體、3%DP、3%AZ與KCZ原料和KCZ普通脂質體相比,具有極顯著差異(P<0.01)。而KCZ原料和KCZ普通脂質體相比,無顯著差異(P>0.05)。傳遞體和3%DP比較具有極顯著性差異(P<0.01)。傳遞體和3%的AZ比較具有極顯著性差異(P<0.01)。3%DP與3%AZ比較具有顯著性差異(P<0.05)。3tf的變形測試TF透過皮膚的形式是通過自身變形來實現(xiàn)的,在一定條件下,TF可比普通脂質體的變形性大5個數(shù)量級。實驗發(fā)現(xiàn),TF中的膽酸鈉能在高壓部位蓄積而使之產生變形,而這種變形,使TF能容易地穿過徑粒小幾倍的孔道。同時,還通過在角質中有TF的存在,證實了TF在通過角質層的過程中經過了多次變形。TF透過皮膚的主要動力是滲透壓差,多項實驗證實,皮膚水化梯度在透皮過程中是天然的,能自發(fā)驅動較大物質進入體內。而當TF混懸液非封閉性用于皮膚表面時,失水后至少可對粒徑在100nm左右的每個TF粒子產生10-9N的壓力,足以使其變形通過角質層間隙而進入皮膚深層甚至進入體循環(huán)。薄膜分散法是制備脂質體最早應用也是至今仍然常用的方法,其制備所得的多為多相脂質體,本實驗采用超聲分散法并結合微孔濾膜法,制備的TF平均粒徑小,但超聲法容易產生熱且有泡沫,須在冰水浴中短時間斷超聲。制備KCZTF時,采用偏酸的緩沖液可將藥物包封率由35%左右提高到50%以上。在實驗確定的色譜條件下,輔料不影響KCZ的測定,通過加樣回收率RSD為0.80%,日內差和日間差RSD均小于2.0%,證實了含量測定方法的可靠性。穩(wěn)定性影響因素實驗表明,在0℃、25℃及4000LX(25℃)條件下KCZTF性狀無明顯變化,藥物包封率變化小;而在40℃、60℃恒溫條件下,藥物包封率變化大,說明藥物滲漏多,且TF外觀變黃,說明溫度能引起脂質材料變化,并且藥物滲漏隨溫度增加而增加。TF具有高度變形性,這一點可以從變形性實驗及其濾過微孔濾膜后的粒徑和包封率可以看出。過濾前,TF和普通脂質體的含量及