日落黃和-胡蘿卜素與bsa相互作用的光譜學(xué)研究

日落黃和-胡蘿卜素與bsa相互作用的光譜學(xué)研究

日落下，通常用于食品和藥物的顏色。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，過度添加過量的異氮色素會(huì)加重肝臟的解毒負(fù)荷，嚴(yán)重?fù)p害肝臟的功能。根據(jù)研究，長(zhǎng)期使用人造藥物會(huì)影響兒童的智力，導(dǎo)致焦慮和其他行為障礙。它是自然界中普遍存在和穩(wěn)定的天然顏色。它的顏色和濃度隨濃度而不同，它可以覆蓋從紅到黃的所有顏色。因此，它被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。它是一種自然界普遍存在且相對(duì)穩(wěn)定的自然色素。這種本身的顏色和濃度隨濃度而不同，它可以覆蓋從紅到黃的所有顏色。因此，它被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。它適用于發(fā)展石油、食品產(chǎn)品和蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如人造奶油、膠囊、魚漿果粉、素食品品和速食面的顏色。此外，它還起到了重要的作用，如日夜腐爛和日落下的黃色和柳樹的分子形狀（scheme1）。隨著社會(huì)的發(fā)展和生活質(zhì)量的提高，人們懷疑合成色素是否對(duì)健康產(chǎn)生了危害。在日常生活中，人們需要添加天然食用色素，但會(huì)逐漸減少含有合成色素的食物。牛血清白蛋白(BSA)是生命體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì),具有貯藏內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物小分子等重要生理功能.有關(guān)小分子與牛血清白蛋白相互作用的研究十分活躍,目前這方面研究主要集中在藥物及一些有機(jī)小分子污染物與牛血清白蛋白的相互作用,而食品添加劑特別是食用色素與之相互作用的研究較少.本文在模擬人體生理pH條件下,采用熒光光譜法、紫外吸收光譜法、紅外光譜法和圓二色譜法研究日落黃和β-胡蘿卜素與BSA的相互作用,獲得它們與BSA結(jié)合過程的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)常數(shù)等基本信息以及對(duì)BSA構(gòu)象的影響,并比較兩者與BSA相互作用過程的差異性.1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)儀器和溶液PELS-55熒光分光光度計(jì)(美國(guó),帶恒溫槽裝置),配有1.0cm熒光比色皿;Agilent8453紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó))配有1.0cm比色皿;Thermo-Nicolet380傅立葉紅外(FT-IR)光譜儀(美國(guó));MOS-450AF-CD圓二色光譜儀(法國(guó)).BSA(合肥博美生物科技有限公司,純度99%,分子量68000)用二次水配制成1.28×10-3和5.0×10-5mol/L儲(chǔ)備液,于1~4℃冰箱中保存.β-胡蘿卜素(美國(guó)Sigma公司)用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配制成8.0×10-5mol/L標(biāo)準(zhǔn)使用液(由于β-胡蘿卜素對(duì)光和熱敏感,溶液都是現(xiàn)配現(xiàn)用).日落黃用二次水配制成4.0×10-3mol/L儲(chǔ)備液.緩沖液為Tris-HCl溶液(pH=7.40):先配制0.2mol/L的Tris溶液,準(zhǔn)確稱取2.422g三羥基甲基氨基甲烷(上海藍(lán)季科技發(fā)展公司),溶于二次水中后,再移入100mL的容量瓶中并定容,取出25mL于100mL的容量瓶中,再加入45mL0.1mol/L的鹽酸溶液,用二次水定容.實(shí)驗(yàn)中所用水均為二次蒸餾水.1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1日落黃和-胡蘿卜素?zé)晒夤庾V的測(cè)定固定激發(fā)波長(zhǎng)為280nm,入射和發(fā)射狹縫寬均為10nm,掃描速度為1200nm/min,記錄250~600nm的熒光光譜.實(shí)驗(yàn)1:在pH=7的Tris-HCl緩沖溶液中,固定BSA的濃度(1.0×10-7mol/L),然后加入不同濃度的日落黃或β-胡蘿卜素(0~1.28×10-6mol/L,每次間隔8.0×10-8mol/L),混合均勻后靜置5min,至反應(yīng)平衡,掃描其熒光光譜.實(shí)驗(yàn)2:固定BSA的濃度為1.0×10-7mol/L,然后加入不同濃度的日落黃(0~1.28×10-6mol/L,每次間隔1.6×10-7mol/L)或β-胡蘿卜素(0~3.2×10-7mol/L,每次間隔4.0×10-8mol/L),混合均勻,放置5min,在溫度298,303和308K下測(cè)其熒光光譜.1.2.2測(cè)定200400nm的吸收光譜在pH=7的Tris-HCl緩沖溶液中,固定BSA的濃度(5.13×10-6mol/L),不斷加入日落黃(0~3.46×10-5mol/L,每次間隔2.67×10-6mol/L)或β-胡蘿卜素(0~1.74×10-5mol/L,每次間隔1.33×10-6mol/L),記錄200~900nm的吸收光譜.1.2.3紅外光譜和圓二色譜分析分別采集BSA(1.01×10-3mol/L)溶液和混合液(藥物和BSA濃度比為1∶1,4∶1,8∶1,12∶1和16∶1)的紅外光譜,掃描范圍為2000~1000cm-1,掃描次數(shù)為32次,取其平均值.在pH=7的Tris-HCl緩沖溶液中,固定BSA的濃度(1.67×10-7mol/L),分步加入日落黃溶液(使[SY]∶[BSA]=0,1,2,4,8,16和32).在恒定充氮的條件下,記錄190~280nm范圍內(nèi)的圓二色光譜,掃描速度為1nm/s.2結(jié)果與討論2.1bsa的動(dòng)態(tài)猝滅事件蛋白質(zhì)中由于色氨酸和酪氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光(牛血清白蛋白激發(fā)波長(zhǎng)280nm,發(fā)射波長(zhǎng)為350nm).圖1為日落黃和β-胡蘿卜素與BSA相互作用的熒光光譜圖,從圖中可看出,在固定BSA濃度條件下,隨著日落黃或β-胡蘿卜素濃度的增加,BSA的熒光強(qiáng)度因被猝滅逐漸減弱,這就表明兩者都能跟BSA結(jié)合.熒光猝滅分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移猝滅等幾類.動(dòng)態(tài)猝滅由猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的碰撞引起,而靜態(tài)猝滅由猝滅劑與熒光物質(zhì)形成了不發(fā)光的配合物引起.動(dòng)態(tài)猝滅過程可由Stern-Volmer方程來描述:式中F0和F分別為未加入和加入化合物時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度,KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),Kq為動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù),[Q]為猝滅劑的濃度,τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子的熒光壽命,對(duì)于生物大分子,τ0=10-8s.假設(shè)猝滅是由動(dòng)態(tài)猝滅引起的,以式(1)中F0/F對(duì)[Q]作圖,得一直線,斜率就是KSV.本實(shí)驗(yàn)考察了日落黃和β-胡蘿卜素在298,303和308K三個(gè)溫度下,對(duì)BSA的猝滅情況,所得的F0/F-[Q]曲線如圖2所示.結(jié)果表明(表1):隨著溫度的升高,兩種物質(zhì)對(duì)BSA的Stern-Volmer曲線的斜率都有所降低,KSV減小,且對(duì)BSA猝滅過程的Kq都遠(yuǎn)大于2×1010L/(mol·s)(各類猝滅劑對(duì)熒光分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)).由此,可推斷日落黃和β-胡蘿卜素對(duì)BSA的熒光猝滅作用不是由于動(dòng)態(tài)碰撞所引起,而是由于形成了復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅.2.2bsa和a-/a--內(nèi)酰胺衍生物的收峰與日落黃的分子鏈上c/o的分子鏈上c/o的分子鏈上c-#的耦合產(chǎn)物2.我們采用紫外吸收光譜法進(jìn)一步研究了日落黃和β-胡蘿卜素與BSA的相互作用.固定BSA,不斷加入日落黃和β-胡蘿卜素的紫外吸收曲線,如圖3所示.由測(cè)定結(jié)果可知,BSA有兩個(gè)紫外吸收峰,分別在220和278nm處,其中278nm處的吸收峰是BSA分子中的色氨酸和酪氨酸中芳雜環(huán)的π-π*和n-π*躍遷引起的,而220nm處的吸收峰則主要是由肽鍵上C=O的n-π*躍遷引起的,與BSA的α-螺旋含量有關(guān).日落黃和β-胡蘿卜素濃度的不斷增大不但使得兩者自身的吸收峰不斷顯現(xiàn),且都使得BSA在278nm處的吸收強(qiáng)度不斷增加,說明這兩種物質(zhì)與BSA發(fā)生了作用,誘導(dǎo)BSA的分子鏈發(fā)生了類似降低pH值所出現(xiàn)的蛋白質(zhì)肽鍵伸展現(xiàn)象以致本來被包含在BSA內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)基團(tuán)裸露出來,使吸收強(qiáng)度增加.2.3靜態(tài)模式的比較在靜態(tài)猝滅中,結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以通過雙對(duì)數(shù)公式求出.設(shè)生物大分子有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位置,可以通過公式推導(dǎo)得到以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖,由斜率和截距可求出藥物分子與蛋白質(zhì)分子作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,所得結(jié)果列于表1中.數(shù)據(jù)表明,兩種物質(zhì)在BSA分子上只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn).并且隨著溫度的升高,結(jié)合常數(shù)Ka減小,進(jìn)一步驗(yàn)證了靜態(tài)猝滅的機(jī)理.同時(shí),我們還可以發(fā)現(xiàn),日落黃和β-胡蘿卜素與BSA都有很強(qiáng)的結(jié)合能力.β-胡蘿卜素是自然界中維生素A的前體,它進(jìn)入體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素A.正常情況下,β-胡蘿卜素在體內(nèi)游離的濃度非常小,大部分是以與BSA結(jié)合的形式儲(chǔ)存起來,只有當(dāng)需要時(shí),人體才會(huì)將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)換成維生素A.因而,β-胡蘿卜素是維生素A的一個(gè)安全來源,不會(huì)因?yàn)閿z食過量而造成維生素A累積中毒現(xiàn)象.而日落黃則有可能在體內(nèi)有一定的蓄積,長(zhǎng)期過量食用可能對(duì)腎臟和肝臟產(chǎn)生一定的傷害.2.4日落黃與bsa的作用力藥物等有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子常借助于靜電作用力、氫鍵作用力、范德華力和疏水作用力等相互結(jié)合形成超分子復(fù)合物.不同小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的作用力類型也不同.Ross等根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律,即ΔS>0可能是疏水和靜電作用力;ΔS<0可能為氫鍵和范德華力;ΔH>0,ΔS>0為典型的疏水作用力;ΔH<0,ΔS<0為氫鍵和范德華力;ΔH≈0或較小,ΔS>0為靜電作用力;ΔH<0是靜電作用力為主要作用力.當(dāng)溫度變化不大的情況下可以把反應(yīng)的焓變?chǔ)近似看作一個(gè)常數(shù),根據(jù)熱力學(xué)公式:式中R為常數(shù)[8.314J/(mol·K)].由式(3)和(4)可得日落黃和β-胡蘿卜素與BSA在不同溫度下反應(yīng)的自由能ΔG、焓變?chǔ)和熵變?chǔ),結(jié)果列于表1中.由表中數(shù)據(jù)判斷,在日落黃-BSA體系中,反應(yīng)的ΔH為負(fù),ΔS為正,可知日落黃與BSA之間的作用力主要為靜電引力;而在β-胡蘿卜素與BSA作用的過程中的ΔH和ΔS均為負(fù)值,表明,氫鍵和范德華力為主要驅(qū)動(dòng)力.同時(shí),兩個(gè)反應(yīng)中的負(fù)的ΔG和ΔH表明,總個(gè)反應(yīng)過程為自發(fā)進(jìn)行的.2.5就結(jié)構(gòu)研究2.5.1日落黃與-胡蘿卜素相互作用的紅外光譜表征維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力有多種,其中最重要的是氫鍵,不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵強(qiáng)度不同,FT-IR譜的酰胺Ι帶(1600~1700cm-1)和酰胺ΙΙ帶(1500~1600cm-1)對(duì)羰基的幾何振動(dòng)和氫鍵結(jié)構(gòu)非常敏感,且酰胺Ι帶相對(duì)酰胺ΙΙ帶對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化更為敏感.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處的環(huán)境發(fā)生變化時(shí),其特征紅外吸收光譜的吸收強(qiáng)度和譜帶位置會(huì)發(fā)生變化.實(shí)驗(yàn)所得的BSA以及日落黃或β-胡蘿卜素存在下BSA的紅外光譜圖如圖4所示.圖4A是不同濃度的日落黃與BSA相互作用的紅外光譜圖,圖4B為相同條件下β-胡蘿卜素與BSA相互作用的紅外光譜圖,從圖中可知,兩物質(zhì)基本都不影響B(tài)SA酰胺ΙΙ帶的峰位置,在BSA酰胺Ι帶的峰位處,日落黃使其峰位置由1662cm-1移至1649cm-1,有13cm-1的變化.而β-胡蘿卜素基本不對(duì)其峰位置產(chǎn)生影響(圖4B中最后一根譜線相對(duì)來說有微小偏移,這可能是由于我們所使用的紅外光譜儀的分辨率為4cm-1,而引起的一定的誤差).對(duì)比兩圖可發(fā)現(xiàn),日落黃可能會(huì)引起B(yǎng)SA構(gòu)象的變化,而β-胡蘿卜素對(duì)其構(gòu)象基本不產(chǎn)生影響.譜圖中,吸收峰強(qiáng)度的不斷減小是由于藥物濃度不斷增大而帶來的體積效應(yīng)使得BSA的相對(duì)濃度不斷減小引起的.2.5.2日落黃在bsa中-螺旋的含量變化為進(jìn)一步考察日落黃對(duì)BSA構(gòu)象的改變,我們采用圓二色譜法研究了日落黃與BSA相互作用,如圖5所示.BSA的圓二色譜在208和222nm處顯示有兩個(gè)負(fù)峰,是BSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰,它們的強(qiáng)度可以反映BSA中α-螺旋的含量.α-螺旋的含量可以通過以下兩個(gè)公式計(jì)算得到:式中,θobs是圓二色譜的毫度值,n為氨基酸殘基的個(gè)數(shù)(583),l是比色皿的寬度,Cp是BSA的摩爾濃度,MRE208為在208nm處的MRE值.當(dāng)逐漸增加日落黃的濃度時(shí),圓二色譜圖中BSA在208和222nm處的負(fù)峰的強(qiáng)度減弱,但峰型基本保持不變,這說明日落黃與BSA的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)多肽鏈的重排,蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化,但是此時(shí)BSA還是以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主.通過式(5)和式(6),計(jì)算得到BSA中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量由65.86%減少至54.67%,這表明日落黃和BSA分子的主要多肽鏈上的氨基酸殘基結(jié)合,對(duì)BSA中因氫鍵作用而形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有一定的破壞,致使構(gòu)成α-螺旋的肽段伸展開來,轉(zhuǎn)變?yōu)檩^為松散的二級(jí)結(jié)構(gòu),從而減小其疏水性.3日落黃與bsa的相互作用本文采用熒光光譜法、紫外吸收光譜法、紅外光譜法和圓二色譜法研究?jī)煞N食用色素日落黃和β-胡蘿卜素與BSA的相互作用,并比較兩者與BSA相互作用過程的差異性.(1)熒光猝滅實(shí)驗(yàn)得出,日落黃和β-胡蘿卜素對(duì)BSA的猝滅作用都是靜態(tài)猝滅,