綠蘿組培快繁技術(shù)要點(diǎn)研究

綠蘿組培快繁技術(shù)要點(diǎn)研究

0國外培養(yǎng)綠蘿的研究進(jìn)展【研究意義】秀麗草，又名金娘、魔鬼藤、金藤等，是天南星科多年生多年生草本植物，發(fā)生在印度尼西亞的索羅門群島（王慶蓮，2002）。它通常生長(zhǎng)在巖石和樹干上，成為一種巨大的觀賞藤本植物，在中國南方各地均有種植。綠蘿耐陰性強(qiáng)，終年常綠，葉面有較厚的角質(zhì)層，能適應(yīng)室內(nèi)干燥的環(huán)境條件，是優(yōu)良的室內(nèi)觀葉植物。此外，還能吸附和去除室內(nèi)空氣中的甲醛、苯、三氯乙烯等污染物，是天然的“空氣凈化器”，越來越受到人們的喜愛，具有較大的市場(chǎng)前景。因此，研究綠蘿快速繁殖技術(shù)特別是組織培養(yǎng)，對(duì)進(jìn)一步研究其遺傳特性和新種質(zhì)的培育具有重要的理論與實(shí)踐意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】我國自1989年開始對(duì)綠蘿組培進(jìn)行研究（李斌麒和趙月芬，1989；林德輝，1989；魯雪華，1990；郭英和梁國魯，2002；張興翠，2004）。近十年來，有關(guān)綠蘿組培的研究漸多。王越銘和李康（1998）以綠蘿莖尖和莖節(jié)為外植體，篩選出誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L，叢生芽培養(yǎng)基為MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L，生根培養(yǎng)基為MS+NAA0.01mg/L。黃鳳蘭等（2004）采用兩種途徑對(duì)小葉綠蘿進(jìn)行組織培養(yǎng)：愈傷組織途徑以不帶節(jié)的莖段為外植體最佳，誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.4mg/L+2,4-D0.8mg/L，胚狀體的分化培養(yǎng)基中不加入生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的效果最好；增強(qiáng)腋芽生枝能力途徑以帶節(jié)的莖段為外植體最佳，誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.05mg/L。范俊崗（2009）以幼嫩葉片為外植體，較系統(tǒng)地研究了綠蘿離體再生技術(shù)體系，發(fā)現(xiàn)外植體愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+TDZ0.2mg/L+NAA0.5mg/L，不定芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L，不定芽增殖最適培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA0.2mg/L。陳廣玉（2011）以綠蘿葉片、帶節(jié)莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，成功獲得再生植株，并建立了快速無性繁殖體系，結(jié)果顯示，最適愈傷組織誘導(dǎo)的外植體為葉片，最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L，最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；采用生根培養(yǎng)和水培兩種途徑對(duì)綠蘿進(jìn)行移栽，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1mg/L?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今為止，人們對(duì)綠蘿已進(jìn)行了大量研究，國內(nèi)主要集中在其栽培技術(shù)方面，有關(guān)其組織培養(yǎng)的研究雖較多，但仍處于起始階段?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以綠蘿葉片及不帶節(jié)的莖段為外植體，研究其組培快繁技術(shù)要點(diǎn)，旨在為綠蘿的再生體系建立提供理論基礎(chǔ)，為綠蘿的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料供試材料選自廣西林業(yè)科學(xué)院花卉研究所種植的綠蘿（Scindapsusaureus），取其葉片和無節(jié)莖段作為外植體。1.2測(cè)試方法1.2.1生長(zhǎng)情況觀察將綠蘿葉片及無節(jié)莖段先用中性洗滌劑洗滌5～10min后用流水沖洗30min，然后在超凈工作臺(tái)上，用75%酒精滅菌30s，無菌水沖洗3～4遍，再用0.1%HgCl2滅菌10min，無菌水再?zèng)_洗3～4遍。將葉片切成0.5cm×0.5cm小塊、莖段切成0.5～1.0cm小段接種在以MS為基本培養(yǎng)基、添加不同濃度激素的培養(yǎng)基上（表1）。每天觀察其生長(zhǎng)情況，20d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織生長(zhǎng)狀況。培養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，每天光照12h，以下培養(yǎng)條件均同。出愈率（%）=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)（個(gè)）/接種外植體數(shù)（個(gè)）×1001.2.2愈傷組織分化將切割好的愈傷組織塊接入以MS為基本培養(yǎng)基、添加不同種類和濃度激素的培養(yǎng)基中（表2），以后每天觀察愈傷組織變化，40d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化數(shù)以及不定芽數(shù)。愈傷組織分化率（%）=產(chǎn)生不定芽的愈傷組織數(shù)（個(gè)）/接種愈傷組織數(shù)（塊）×100增殖系數(shù)=產(chǎn)生不定芽數(shù)（個(gè)）/接種愈傷組織數(shù)（塊）1.2.3生根培養(yǎng)將生長(zhǎng)健壯的無根小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中（表3）,20d后觀察生根情況。1.2.4苗苗栽植后放養(yǎng)將已生根的組培苗置于室溫并打開瓶蓋進(jìn)行煉苗2～3d，然后將苗取出，冼凈殘留培養(yǎng)基，用1000倍的多菌靈溶液浸泡后移栽到透氣性良好的基質(zhì)中，澆透水，20d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。2結(jié)果與分析2.1外植體誘導(dǎo)分離的比較在研究過程中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織首先在外植體的切口邊緣處逐漸產(chǎn)生。由表1可知，在無激素的培養(yǎng)基上，兩種外植體的出愈率均為零，表明在綠蘿愈傷組織誘導(dǎo)中，激素6-BA和NAA是必需的。在不同培養(yǎng)基上，隨著NAA濃度的增加，葉片愈傷組織產(chǎn)生的時(shí)間縮短，但莖段愈傷組織產(chǎn)生的時(shí)間無明顯變化；隨著6-BA濃度的升高，葉片和莖段愈傷組織產(chǎn)生的時(shí)間均呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)。對(duì)不同外植體的誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)葉片出愈率均低于莖段，且需要的誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)；莖段的出愈率最高可達(dá)100%，而葉片最高為66%；莖段產(chǎn)生愈傷組織所需時(shí)間最短為11d，而葉片最短時(shí)間為18d，說明葉片產(chǎn)生愈傷組織的能力不及莖段。此外，在不同培養(yǎng)基中，產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地也有所不同，大部分培養(yǎng)基均產(chǎn)生褐色愈傷組織。當(dāng)以葉片為外植體時(shí)，其在培養(yǎng)基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L的出愈率最高（66%），產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間最短，為18d，愈傷組織為淺綠色。當(dāng)以莖段為外植體時(shí)，培養(yǎng)基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的出愈率最高，達(dá)100%，出現(xiàn)愈傷組織的時(shí)間短，為12d，愈傷組織質(zhì)地表現(xiàn)較好，沒有褐色愈傷組織。綜上所述，以葉片和莖段為外植體，均能產(chǎn)生愈傷組織，但莖段產(chǎn)生愈傷較快；葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L，莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基均為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。2.2培養(yǎng)基濃度對(duì)愈傷組織增殖的影響由表2可以看出，適量的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比對(duì)愈傷組織的分化有明顯的作用。在未添加任何激素的培養(yǎng)基上，愈傷組織分化率很低，葉片和莖段分別為12%、15%，增殖系數(shù)也低，分別為1.7和2.2；但在添加不同激素的培養(yǎng)基上，不論何種外植體，愈傷組織的分化率均達(dá)到100%，且增殖系數(shù)較高。不同激素水平對(duì)綠蘿愈傷組織分化的影響主要表現(xiàn)在增殖系數(shù)和產(chǎn)生不定芽的最短時(shí)間以及不定芽的長(zhǎng)勢(shì)上。在添加一定濃度的NAA或IBA條件下，大部分處理愈傷組織增殖系數(shù)隨培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加呈上升趨勢(shì)，而不定芽產(chǎn)生時(shí)間呈減少趨勢(shì)，但不定芽長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酰辉谝欢?-BA濃度條件下，添加較高濃度NAA或IBA更有利于提高愈傷組織增殖系數(shù)，縮短不定芽產(chǎn)生時(shí)間，不定芽長(zhǎng)勢(shì)也較好。培養(yǎng)基添加2.0mg/L6-BA與0.2～0.3mg/LNAA的組合（培養(yǎng)基6和7）及2.0mg/L6-BA與0.3mg/LIBA組合（培養(yǎng)基16）可獲得較高增殖系數(shù)、較短的不定芽產(chǎn)生時(shí)間和較好的不定芽長(zhǎng)勢(shì)；3.0mg/L6-BA與0.2～0.3mg/LNAA的組合（培養(yǎng)基9和10）及3.0mg/L6-BA與0.2～0.3mg/LIBA組合（培養(yǎng)基18和19）雖也可獲得較高增殖系數(shù)、較短的不定芽產(chǎn)生時(shí)間，但不定芽長(zhǎng)勢(shì)較弱。其中，在培養(yǎng)基10即添加3.0mg/L6-BA、0.3mg/L組合上，葉片愈傷組織增殖系數(shù)最高，為10.5，產(chǎn)生不定芽所需時(shí)間最短，為23d，不定芽長(zhǎng)勢(shì)較弱；莖段的增殖系數(shù)為11.2，產(chǎn)生不定芽的時(shí)間最短為12d，但不定芽長(zhǎng)勢(shì)一般。而在培養(yǎng)基6上，葉片愈傷組織的增殖系數(shù)為10.2,24d能夠產(chǎn)生不定芽，長(zhǎng)勢(shì)健壯；莖段愈傷組織的增殖系數(shù)最高，為11.5，莖段不定芽產(chǎn)生需要14d，芽的長(zhǎng)勢(shì)健壯。葉片在培養(yǎng)基7、8、17上產(chǎn)生不定芽所需時(shí)間雖然也只需24d，但不定芽長(zhǎng)勢(shì)一般，不利于后期的生根以及移栽。綜上所述，兩種外植體進(jìn)行繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L，增殖系數(shù)高，產(chǎn)生不定芽時(shí)間短，長(zhǎng)勢(shì)也好。2.3naa濃度對(duì)植株生長(zhǎng)和根系老化的影響根的好壞不僅影響移栽的成活率，對(duì)植株后期的生長(zhǎng)也有直接影響。根系粗壯、長(zhǎng)度適宜、毛細(xì)根多有利于移栽成活。從表3可以看出，不論是否添加了NAA，綠蘿都能100%生根，但不同培養(yǎng)基中根生長(zhǎng)情況有較大差異。接種在1/2MS培養(yǎng)基上的植株，根少且細(xì)，植株生長(zhǎng)一般，而接種在含有NAA培養(yǎng)基上的植株，隨著NAA濃度的升高，植株生長(zhǎng)轉(zhuǎn)好；當(dāng)NAA濃度為0.20mg/L時(shí)，植株長(zhǎng)勢(shì)好，根多、粗壯，須根也多，根白色，根尖為白色說明正處于細(xì)胞分裂旺盛期；但NAA濃度超過0.20mg/L后，植株長(zhǎng)勢(shì)又開始變差，特別是根的顏色明顯發(fā)黃，根系出現(xiàn)老化的趨勢(shì)?？梢奛AA對(duì)綠蘿生根有直接影響：在一定NAA濃度范圍內(nèi)，隨著其濃度升高，促進(jìn)植株生長(zhǎng)的作用明顯，當(dāng)NAA超過一定濃度時(shí)，就會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，綠蘿的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.2mg/L。2.4集體苗移植將獲得的綠蘿生根組培苗進(jìn)行煉苗移栽，保持適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸龋?0d后，成活率可達(dá)98%。3漢國時(shí)期愈傷組織的誘導(dǎo)與分化本研究結(jié)果表明，綠蘿葉片和莖段兩種外植體均能產(chǎn)生愈傷組織，但莖段較葉片產(chǎn)生愈傷快，產(chǎn)生不定芽也快，可見進(jìn)行綠蘿組培以莖段為外植體為宜。然而利用莖段為外植體對(duì)母株傷害較大，利用葉片等則可減少對(duì)母株的損傷。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，特別是工廠化育苗過程中，選擇外植體要考慮多方面的因素，如果材料較多，可以采用莖段；如果材料稀缺、珍貴，則宜選擇葉片為外植體。在誘導(dǎo)愈傷組織過程中，可以觀察到愈傷組織發(fā)生了褐變。褐變的原因較多，外植體材料的生理狀態(tài)、基因型、同一基因型的不同栽培條件、營養(yǎng)狀況、生長(zhǎng)部位和大小、培養(yǎng)基的成分、外源激素的含量及比例、培養(yǎng)條件等都會(huì)對(duì)褐變有影響。Kahn(1977）、Mager和Harel(1979）等研究表明，蘋果和梨的組織褐變與其酚類物質(zhì)含量密切相關(guān)。張朝軍等（2005）在棉花胚性愈傷研究中認(rèn)為，氮源配比不合適是褐變現(xiàn)象的主要誘因，與KT、6-BA、IAA等激素關(guān)系不明顯。褐變?cè)诮M培過程中普遍存在，影響植物的正常生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株死亡。因此預(yù)防褐化是組培成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。防止褐變的措施一般包括選取適當(dāng)?shù)耐庵搀w，選擇合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，或者在培養(yǎng)基中附加Vc、活性炭等，對(duì)減輕和防止褐變有明顯的效果。本研究尚未對(duì)綠蘿組培的褐變進(jìn)行研究，今后可進(jìn)行深入研究。在組織培養(yǎng)中，常利用細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素來刺激和誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)與分化，本研究以6-BA、NAA和IBA3種激素不同濃度水平調(diào)控愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，提高了植株再生頻率，建立了完整的無性系。愈傷組織途徑是一個(gè)較為漫長(zhǎng)的過程，且容易引起變異，不能保持植株原有的優(yōu)良性狀。而通過不定芽途徑建立離體快繁體系，不但節(jié)省了時(shí)間，而且保持了植株原有的優(yōu)良性狀。因此，通過