空氣中主要污染真菌的分離鑒定及抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)研究

空氣中主要污染真菌的分離鑒定及抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)研究

植物組織培養(yǎng)是在植物生化的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的植物繁殖技術(shù)。經(jīng)過(guò)近一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展,這項(xiàng)技術(shù)已在科學(xué)研究和生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用,但它的技術(shù)環(huán)節(jié)還存在不少問(wèn)題。微生物污染是組織培養(yǎng)中普遍存在的問(wèn)題。在培養(yǎng)基中添加殺菌劑已成為防治污染的一種重要方法得到廣泛運(yùn)用。但目前研究主要集中在防治細(xì)菌污染方面,對(duì)真菌污染較少顧及。韓美麗等在綠巨人組培中實(shí)驗(yàn)了青霉素鈉、先鋒霉素和大慶霉素對(duì)繼代培養(yǎng)中細(xì)菌污染的抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)小組在組培過(guò)程中發(fā)現(xiàn):接種室環(huán)境中存在大量真菌孢子,常規(guī)方法很難避免真菌污染,且真菌污染有著爆發(fā)突然,感染面積大等特點(diǎn),一旦爆發(fā)會(huì)導(dǎo)致全部材料報(bào)廢,對(duì)一些珍貴的材料來(lái)說(shuō)是很嚴(yán)重的威脅。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)組培過(guò)程中易污染的真菌分離與鑒定,并進(jìn)行一些殺菌劑的抑菌實(shí)驗(yàn),以期能找到有效降低真菌污染的方法。1實(shí)驗(yàn)材料1.1培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基,馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。1.2集體培訓(xùn)材料和添加劑1.2.1培訓(xùn)材料煙草(華東師大生物站種植)。1.2.2消毒試劑醫(yī)用抗生素:制霉菌素、灰黃霉素、酮康唑。實(shí)驗(yàn)室常用殺菌劑:次氯酸鈉。2實(shí)驗(yàn)方法2.1污染樣品的收集和鑒定2.1.1培養(yǎng)強(qiáng)菌落將5個(gè)MS培養(yǎng)基平板開蓋后放置在超凈工作臺(tái)上,靜置20min后,蓋上培養(yǎng)皿,放入培養(yǎng)箱25℃下培養(yǎng)3～5d,形成明顯的菌落以便分離鑒定。2.1.2分離和鑒定使用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)收集到的真菌進(jìn)行化線分離,純化培養(yǎng),直至形成單菌落。通過(guò)形態(tài)學(xué)特征鑒定真菌。2.2混有真菌孢子聯(lián)合抑菌環(huán)的檢測(cè)已從鑒定的真菌中每屬選取1個(gè)代表種為材料,使用濾紙片法測(cè)定各種殺菌劑的抑菌效果。2.2.1從真菌培養(yǎng)物中提取孢子,稀釋至102cfu/ml。將孢子懸浮液以每付平板0.5ml的量加入到50℃左右的MS培養(yǎng)基中,混勻后傾到平板。2.2.2用無(wú)菌鑷子取半徑0.5cm的圓形無(wú)菌濾紙片,分別浸泡在經(jīng)過(guò)濾滅菌的不同濃度的制霉菌素、灰黃霉素、酮康唑(均分為200mg/L、50mg/L、10mg/L3個(gè)濃度)及次氯酸鈉溶液(分2%、0.5%、0.1%3個(gè)濃度)中1min,等距置于混有真菌孢子的培養(yǎng)基表面。每組設(shè)6個(gè)重復(fù)樣本。2.2.3于25℃培養(yǎng)5d后觀察結(jié)果。如有抑菌作用,則濾紙片周圍無(wú)菌生長(zhǎng),形成抑菌環(huán)。根據(jù)抑菌環(huán)大小,判斷抑菌效果。2.3抑菌環(huán)試驗(yàn)設(shè)計(jì)由于殺菌劑有其抑菌譜,無(wú)一種殺菌劑對(duì)所有真菌都有效,且長(zhǎng)期使用單一品種抗生素易使真菌產(chǎn)生抗藥性。故從試驗(yàn)抗生素中選出3種抑菌譜廣,抑菌效果好的殺菌劑,按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理Lg(34)),配成9組濃度不同的混合殺菌劑,對(duì)同時(shí)混有上述5種真菌的MS培養(yǎng)基進(jìn)行抑菌環(huán)試驗(yàn)。每組設(shè)6個(gè)重復(fù)樣本。2.4無(wú)殺菌ms培養(yǎng)基的制備從9組混合殺菌劑中選出3組抑菌效果好且濃度水平低的組合作為培養(yǎng)基添加劑使用到組培中。將煙草嫩葉用0.1%升汞表面消毒5min后,在普通實(shí)驗(yàn)環(huán)境下(無(wú)任何消毒措施),接種到分別加入上述3組殺菌劑的MS培養(yǎng)基及1組無(wú)殺菌劑MS培養(yǎng)基中。再嚴(yán)格按照組培消毒要求處理,在超凈臺(tái)上接種同一材料到1組無(wú)殺菌劑MS培養(yǎng)基中作為對(duì)照。每組設(shè)10個(gè)重復(fù)樣本。光照培養(yǎng)箱中,24h光照,25℃培養(yǎng)。3周后觀察愈傷組織生長(zhǎng)情況及污染狀況。3結(jié)果與分析3.1真菌屬part通過(guò)對(duì)空氣中污染真菌的分離純化,共獲得9種真菌,其中曲霉屬(Aspergillus)2種,毛霉屬(Mucor)2種,青霉屬(Penicillum)3種,木霉屬(Trichoderma)1種,根霉屬(Rhizopus)1種。這些均為常見真菌,它們的孢子在空氣中分布廣,含量大,易造成污染。且其在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速,繁殖旺盛,較短時(shí)間內(nèi)就會(huì)威脅到植物的生存。組培中需對(duì)這些真菌重點(diǎn)防治。3.2種藥物的抑菌效果從表1中可知,高濃度次氯酸鈉對(duì)這5種真菌均有很強(qiáng)的抑制作用,而低濃度(0.1%)則無(wú)作用。在3種抗生素中,制霉菌素抑菌效果最明顯,在50mg/L水平上對(duì)5種真菌都有作用,且效果與200mg/L相似,但10mg/L水平抑菌作用較差?；尹S霉素的抑菌效果不理想,對(duì)根霉與毛霉無(wú)任何作用。所以選用次氯酸鈉,制霉菌素和酮康唑進(jìn)行混合抑菌試驗(yàn)。3.3高分法組培試驗(yàn)從表2中可知,第3、6、8、9組抑效果較好。其中第9組效果最好,培養(yǎng)皿內(nèi)無(wú)菌生長(zhǎng),但考慮到高濃度的抗生素對(duì)組培材料有強(qiáng)殺傷作用,選取第3、6、8組進(jìn)行組培試驗(yàn)。3.4種藥物對(duì)工養(yǎng)生長(zhǎng)的影響由表3可知,在未消毒情況下使用殺菌劑的組別真菌污染率明顯低于無(wú)殺菌劑組,且與嚴(yán)格滅菌情況下污染率相近。殺菌劑組的愈傷組織生長(zhǎng)狀況差于無(wú)殺菌劑組,第8組抗生素濃度最高,組培材料全被殺死。第3組中次氯酸鈉濃度較高,植物生長(zhǎng)狀況差。殺菌劑濃度最低的第6組,殺菌效果好,植物生長(zhǎng)狀況也僅稍差于無(wú)殺菌劑組,是組培中防治空氣污染真菌良好的培養(yǎng)基添加劑。4抑菌防真菌污染劑的篩選結(jié)果本實(shí)驗(yàn)共從接種室中獲取9種真菌,其中曲霉屬(Aspergillus)2種,毛霉屬(Mucor)2種,青霉屬(Penicillum)3種,木霉屬(Trichoderma)1種,根霉屬(Rhizopus)1種。利用殺菌劑防治植物組織培養(yǎng)污染,可大大降低污染率,降低生產(chǎn)成本,通過(guò)對(duì)這5屬真菌的抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種殺菌劑中次氯酸鈉與制霉菌素抑菌效果最好。用50mg/l酮康唑+50mg/l制霉菌素+0.1%次氯酸鈉組成的混合殺菌劑,抑菌效果好,對(duì)植物傷害小,是良好的防真菌污染添加劑。本實(shí)驗(yàn)篩選出的殺菌劑組合已能得到與常規(guī)消毒類似的效果。如將該殺菌劑和常規(guī)消毒手段一同使用,則可達(dá)到預(yù)防真菌污染這一目的。在用某些珍貴的植物材料進(jìn)行組培時(shí),可使用此殺菌劑預(yù)防真菌污染,從而得到更多更健康