茶堿與牛血紅蛋白相互作用的熒光光譜法研究

茶堿與牛血紅蛋白相互作用的熒光光譜法研究

蛋白質(zhì)與內(nèi)源性化合物和許多藥物分子之間的相互作用的研究一直受到關(guān)注。血紅蛋白(Hb)是一種由4個(gè)亞基組成以血紅素為輔基的結(jié)合蛋白,是動(dòng)物及人體內(nèi)執(zhí)行輸氧任務(wù)的蛋白質(zhì)。茶堿為黃嘌呤的N-甲基衍生物,對(duì)呼吸道平滑肌具有較強(qiáng)的直接松弛作用,可緩解支氣管痙攣,是目前常用的平喘藥之一,但因其安全性范圍較小,常需進(jìn)行臨床藥物監(jiān)測(cè)。目前,對(duì)茶堿以及與蛋白質(zhì)作用的研究,主要是關(guān)于茶堿的血藥濃度監(jiān)測(cè)以及其衍生物的發(fā)光特性、對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響等方面,而對(duì)于血紅蛋白與茶堿的作用機(jī)理及熱力學(xué)性質(zhì)則少有報(bào)道。本文通過熒光光譜技術(shù)研究了茶堿與牛血紅蛋白(BHb)間的相互作用,并利用生物大分子與小分子作用的位點(diǎn)結(jié)合模型,對(duì)其猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。同時(shí)考察了茶堿對(duì)牛血紅蛋白構(gòu)象的影響。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)試劑和儀器帶恒溫系統(tǒng)的LS-50B型熒光光度計(jì)(美國(guó)Perkin-Elmer公司);pHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);ZC-18Q智能型超級(jí)恒溫水槽(寧波天恒儀器廠);高純水制備儀(日本Millipore公司)。茶堿(分析純,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制成1.188×10-3mol/L的儲(chǔ)備液待用;牛血紅蛋白(Belgoum,美國(guó))配制成2.65×10-6mol/L儲(chǔ)備溶液并于冰箱中(溫度低于5℃)保存,以上試劑均用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液(內(nèi)含0.15mol/LNaCl維持離子強(qiáng)度)配制。除Tris為生化試劑外,其余試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為高純水(電阻率為18.2MΩ·cm)。1.2熒光光譜測(cè)定移取2.5mL2.65×10-6mol/LBHb于1cm的石英比色皿中,用微量注射器逐次加入1.188×10-3mol/L的茶堿溶液進(jìn)行熒光滴定(滴定劑累加體積小于0.1mL),每次加入溶液后混合均勻,在一定溫度下作用10min后,于280nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光掃描。光源為脈沖式氙燈,發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為5nm,掃描速度500nm/min,在LS-50B型熒光分光光度計(jì)上記錄300～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜;固定Δλ=20或60nm,記錄茶堿與BHb作用的同步熒光光譜。2結(jié)果與討論2.1關(guān)于光學(xué)常數(shù)和自殺機(jī)制的討論2.1.1服務(wù)意識(shí)不強(qiáng)的織物和茶堿蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光來自于分子中的色氨酸殘基和酪氨酸殘基。在280nm光激發(fā)下,BHb分子中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光發(fā)射峰位于330～340nm附近。圖1為固定BHb濃度下體系的熒光發(fā)射光譜隨茶堿濃度的變化。可以看出,隨著茶堿濃度的增加,發(fā)射峰波長(zhǎng)保持在337nm左右,但蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低,說明兩者之間存在著相互作用,發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。2.1.2熒光或ksv反應(yīng)前后a熒光物質(zhì)分子可以與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間發(fā)生導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用,這一現(xiàn)象被稱為熒光猝滅。廣義上說,任何可以使熒光強(qiáng)度降低的作用都可以稱之為熒光猝滅。熒光猝滅過程通?？梢苑譃閯?dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用引起的,其過程遵循Stern-Volmer方程。F0/F=1+Ksvcq=1+Kqτ0cq(1)式中:F0和F分別表示不加入和加入猝滅劑時(shí)體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度;Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)(即Stern-Volmer猝滅常數(shù));cq為猝滅劑的濃度;Kq為熒光猝滅速率常數(shù),各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大Kq值一般為2.0×1010L·mol-1·s-1;τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的平均壽命,生物大分子的熒光平均壽命一般約為10-8s-1。根據(jù)圖1,假設(shè)茶堿對(duì)BHb的熒光猝滅過程為動(dòng)態(tài)猝滅,則由式1作出血紅蛋白熒光猝滅的Stern-Volmer曲線,如圖2所示,由圖中直線的斜率及截矩可求出Ksv和Kq,結(jié)果見表1。從表1結(jié)果看,Kq的數(shù)值在1012數(shù)量級(jí),遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1,從這個(gè)角度考慮,茶堿對(duì)BHb的猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅。2.2茶堿與brb的相互作用關(guān)系茶堿與BHb的靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)可用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系式求得,其常數(shù)KLB與熒光強(qiáng)度、猝滅劑濃度之間的關(guān)系為:1F0?F=1F0+1KLBF0cq(2)作(F0-F)-1～cq-1圖以求取KLB等相關(guān)數(shù)值。當(dāng)溫度變化不大時(shí),結(jié)合反應(yīng)的焓變?chǔ)可看成一個(gè)常數(shù),根據(jù)下列熱力學(xué)公式3～5可以求得結(jié)合反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變?chǔ)?、焓變?chǔ)?、熵變?chǔ)?(見表2)。ΔG?=?RTlnK?(3)ΔS?=(ΔH??ΔG?)/T(4)lnK?2K?1=ΔH?R(1T1?1T2)(5)從表2可以判斷,茶堿與BHb的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)過程(ΔG?<0)。根據(jù)藥物與蛋白質(zhì)間的作用力類型,當(dāng)ΔH>0,ΔS>0時(shí),茶堿與血紅蛋白分子間主要為疏水作用力結(jié)合,ΔG?主要來自熵變的貢獻(xiàn),即熵變效應(yīng)在藥物與血紅蛋白相互作用的穩(wěn)定性中占主導(dǎo)地位。同時(shí)可以看出,溫度對(duì)茶堿與BHb的結(jié)合常數(shù)KLB影響較小,故可進(jìn)一步確定茶堿對(duì)BHb的猝滅為靜態(tài)猝滅。2.3茶堿結(jié)合brb的結(jié)果分析茶堿對(duì)BHb的猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅,則二者的結(jié)合符合熒光物質(zhì)-猝滅劑間的結(jié)合表達(dá)式:lg[(F0?F)/F]=lgK+nlg[cq](6)由式6作lg[(F0-F)/F]～lgcq圖,在T=295.15K時(shí),其線性方程為lg[(F0?F)/F]=4.3048+1.029lgcq(7)線性相關(guān)系數(shù)r=0.9998。由所得直線的截矩計(jì)算得表觀結(jié)合常數(shù)K=2.0174×104L/mol,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.029?？梢钥闯?茶堿與BHb的作用較強(qiáng),且每一個(gè)茶堿分子與一個(gè)蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成配合物;同時(shí)溫度對(duì)茶堿與血紅蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及表觀結(jié)合常數(shù)影響較小,這也更加說明茶堿與血紅蛋白的作用過程為靜態(tài)猝滅。2.4不同濃度茶堿對(duì)酪氨酸和色氨酸殘基的影響對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜,△λ=15nm時(shí)僅表現(xiàn)為酪氨酸殘基的熒光,△λ=60nm時(shí)則顯示色氨酸殘基的熒光。因殘基的最大吸收波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān),故由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。若最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移,表明殘基所處環(huán)境的極性增加,藍(lán)移則表明疏水性增加。固定血紅蛋白濃度,逐漸增大茶堿的濃度,繪制血紅蛋白的同步熒光光譜。經(jīng)實(shí)驗(yàn)獲得,分別選擇波長(zhǎng)差△λ=20和60nm考察茶堿對(duì)酪氨酸和色氨酸殘基的影響(圖3a、b)。從圖中可以看出,隨著茶堿濃度增大,酪氨酸和色