柱相色譜法分離酮康唑的研究

柱相色譜法分離酮康唑的研究

身體蛋白質(zhì)的組成包括氨基酸、糖和其他代謝過(guò)程中的酶、受體和載體。當(dāng)外包藥物進(jìn)入生物體時(shí)，它們的反應(yīng)方法與不同的分子識(shí)別反應(yīng)相同。因此，這兩種藥物通常具有不同的藥理作用，它們的代謝路徑和受體選擇也不同。換句話說(shuō)，存在三維選擇性。目前,臨床上常用的2000余種化學(xué)藥物中,手性藥物約占40%,單一對(duì)映體藥物不足100種;大多數(shù)藥物以外消旋體形式供藥用,因此研究高分離效能、高靈敏度的手性藥物拆分和測(cè)定方法對(duì)提高藥效和控制藥物質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。酮康唑(ketoconazole,KTZ)是一種廣譜抗真菌口服藥物,盡管酮康唑有兩個(gè)手性中心,但這兩個(gè)手性中心上的氫原子和2,4-二氯苯基都在二氧戊環(huán)的同側(cè),存在較大的空間位阻,因而酮康唑只有一對(duì)對(duì)映體,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究表明,它的兩個(gè)對(duì)映體具有不同的藥理活性,左旋酮康唑比右旋酮康唑的藥理活性高2～4倍。目前臨床上以外消旋體供藥,因此研究酮康唑的手性拆分方法對(duì)研究其藥理和藥效作用都具有重要的意義。Castro-Puyana等和Crego等用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)酮康唑進(jìn)行了手性拆分,流動(dòng)相中含0.1mol/L磷酸鹽(pH3.3)、20.0mmol/L七(2,3,6-三-O-甲基)-β-CD,前者在11min內(nèi)兩個(gè)對(duì)映體達(dá)到基線分離,分離度為6.0;后者在7min內(nèi)兩個(gè)對(duì)映體達(dá)到基線分離,分離度為5.2。Toribio等用超臨界流體色譜法,以CO2作為流動(dòng)相,分別用ChiralpakAD手性柱(多糖的羥基被3,5-二甲基苯基氨基甲酸鹽取代后作為手性固定相)和ChiralcelOD手性柱(纖維素的羥基被3,5-二甲基苯基氨基甲酸鹽取代后作為手性固定相)成功分離了酮康唑?qū)τ丑w。Bernal等分別用ChiralpakAD手性柱和ChiralcelOD手性柱對(duì)酮康唑進(jìn)行了拆分,流動(dòng)相組成為醇類(甲醇、乙醇或2-丙醇)和水,保留時(shí)間都超過(guò)60min。但未見(jiàn)采用手性流動(dòng)相添加法拆分酮康唑?qū)τ丑w的報(bào)道。本文采用反相C18鍵合固定相,在流動(dòng)相中添加手性選擇劑,實(shí)現(xiàn)了酮康唑?qū)τ丑w的拆分,并對(duì)影響酮康唑手性拆分的主要因素(如環(huán)糊精的種類和濃度、流動(dòng)相pH值、柱溫以及甲醇和磷酸鹽溶液的體積比等)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,采用磺丁基-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD)作為手性流動(dòng)相添加劑,可以成功地拆分酮康唑外消旋體,分離效果好,方法簡(jiǎn)便,對(duì)于酮康唑手性拆分具有應(yīng)用價(jià)值。1實(shí)驗(yàn)部分1.1精密旋光儀測(cè)定LC-10ADvp高效液相色譜儀(日本島津公司);TL-9900色譜工作站;FA1104N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);pHs-2C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠);WZZ-2B自動(dòng)旋光儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。酮康唑外消旋體(西安楊森制藥公司提供);SBE-β-CD、磺丁基-羥丙基-β-環(huán)糊精(SBE-HP-β-CD)、羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)(南京師范大學(xué)江蘇省醫(yī)藥超分子材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供);β-CD(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);磷酸二氫鈉(化學(xué)純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);濃磷酸(化學(xué)純,南京化學(xué)試劑廠);甲醇(色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司);三乙胺(化學(xué)純,上海金山亭新化工試劑廠);實(shí)驗(yàn)用水均為重蒸水。1.2供試品溶液配制的配制:精密稱取酮康唑適量,用甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度約為1.00g/L的貯備液,再用流動(dòng)相稀釋成5.00mg/L的供試品溶液,在4℃下保存。1.3磺丁基--環(huán)糊精的將酸鈉某品牌色譜柱:DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm,迪馬公司)。流動(dòng)相:甲醇-0.02mol/L磷酸二氫鈉(體積比為60∶40,含1.0mmol/L磺丁基-β-環(huán)糊精及0.02%三乙胺,稀磷酸調(diào)節(jié)pH3.00);流速:1.00mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):225nm;進(jìn)樣量:20μL。使用前,流動(dòng)相經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾并超聲脫氣。2結(jié)果與討論2.1手性添加劑的選擇本實(shí)驗(yàn)以SBE-β-CD、β-CD、HP-β-CD、SBE-HP-β-CD作為手性選擇劑,分別考察了它們對(duì)酮康唑?qū)τ丑w手性分離的影響。由圖2可見(jiàn)在相同條件下,只有SBE-β-CD可使酮康唑?qū)τ丑w完全分離,而β-CD只能部分拆分酮康唑?qū)τ丑w,HP-β-CD和SBE-HP-β-CD均不能拆分酮康唑?qū)τ丑w。這可能是由于酮康唑的苯環(huán)進(jìn)入SBE-β-CD的疏水空腔,形成范德華力;酮康唑的氧原子和SBE-β-CD的羥基形成氫鍵;而酮康唑含有哌嗪基顯堿性,在實(shí)驗(yàn)的pH條件下帶正電荷,而磺丁基帶負(fù)電荷,產(chǎn)生靜電作用相互吸引;這3種因素的共同作用使得SBE-β-CD和酮康唑?qū)τ丑w形成了穩(wěn)定程度有異的包結(jié)物,因此成功拆分了酮康唑?qū)τ丑w。β-CD分子像個(gè)無(wú)底的桶,其中2位和3位上的羥基在空腔的大口端,6位上的羥基在空腔的小口端。2位上的羥基相對(duì)于環(huán)糊精空腔是朝外的,對(duì)環(huán)糊精的手性選擇幾乎沒(méi)有影響;3位上的羥基的方向與環(huán)糊精的軸線幾乎平行,所以3位上的取代基的性質(zhì)對(duì)環(huán)糊精的立體選擇性影響最大;6位上的取代基的性質(zhì)主要影響環(huán)糊精分子的形狀,如果在6位上引入極性小、體積大的基團(tuán),會(huì)使環(huán)糊精分子的小口端變大,而大口端變小。若SBE-HP-β-CD的磺丁基和羥丙基取代發(fā)生在3位的羥基上,則由于空間位阻作用,使酮康唑進(jìn)入環(huán)糊精的空腔困難,導(dǎo)致手性匹配性差,這可能是其不能很好地拆分酮康唑?qū)τ丑w的原因。而HP-β-CD和β-CD是中性的,不能和酮康唑形成靜電作用,所以拆分效果也不理想。因此實(shí)驗(yàn)選擇SBE-β-CD作為手性添加劑。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了SBE-β-CD的濃度對(duì)酮康唑?qū)τ丑w手性分離的影響。從圖3可見(jiàn),酮康唑?qū)τ丑w的分離度隨著SBE-β-CD濃度的增加而增大,同時(shí)保留時(shí)間也增加。這是因?yàn)镾BE-β-CD濃度的增加增強(qiáng)了其與對(duì)映體之間的相互作用,使對(duì)映體之間的色譜行為差異擴(kuò)大,因此提高了分離度?？紤]到增加SBE-β-CD的濃度影響色譜柱的使用壽命,同時(shí)保留因子也會(huì)增大,保留時(shí)間延長(zhǎng),柱效降低,所以本文選擇SBE-β-CD的濃度為1.0mmol/L。2.2ph值對(duì)sbe--cd分離度的影響在手性拆分過(guò)程中,pH值是一個(gè)重要參數(shù)。在其他條件不變時(shí),酮康唑?qū)τ丑w在pH值2.70～5.00范圍內(nèi)可以達(dá)到基線分離。由表1可見(jiàn),酮康唑兩個(gè)對(duì)映體的分離度和保留因子在此范圍內(nèi)均隨著pH值的增加而增大。這可能是因?yàn)楫?dāng)pH值比較低時(shí),SBE-β-CD2位上的羥基質(zhì)子化,不能和酮康唑的氧原子形成氫鍵,使手性匹配性較差;而當(dāng)pH值增大時(shí),2位上的羥基的質(zhì)子化程度減小,使手性匹配性增加,分離度也相應(yīng)增大。酮康唑是一種弱堿,pH值增加,其電離受到抑制,使分子的極性降低,在反相色譜柱上的保留增強(qiáng),保留因子相應(yīng)增大。當(dāng)pH>5時(shí),酮康唑?qū)τ丑w在反相色譜柱上的保留時(shí)間在1h以上,拆分效率明顯降低。故本文最終選擇pH為3.00。2.3增加甲醇的比例流動(dòng)相中甲醇的比例對(duì)拆分效果的影響很大。由表2可以看出,增加甲醇的比例可以使酮康唑?qū)τ丑w的保留因子減少,同時(shí)分離變差。這可能是由于甲醇與酮康唑?qū)τ丑w競(jìng)爭(zhēng)流動(dòng)相中的磺丁基-β-環(huán)糊精的疏水空腔,使得分離度減小。2.4色譜條件選擇磺丁基-β-環(huán)糊精和酮康唑?qū)τ丑w分子形成包結(jié)物是一個(gè)放熱的過(guò)程,因此降低溫度會(huì)抑制酮康唑分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng),增加包結(jié)物的穩(wěn)定性和分子之間的手性匹配,所以降低溫度對(duì)手性拆分有利,結(jié)果見(jiàn)圖4。但是柱溫太低會(huì)增加流動(dòng)相的黏度,使色譜系統(tǒng)柱壓過(guò)高。綜合考慮以上因素,最終選擇柱溫為30℃。綜上所述,手性拆分KTZ對(duì)映體的最佳的色譜條件如“1.3”節(jié)所述。在優(yōu)化的色譜條件下酮康唑?qū)τ丑w的分離結(jié)果見(jiàn)圖5,由此可見(jiàn)在6min之內(nèi)就可使酮康唑?qū)τ丑w分離,分離度達(dá)2.05。2.5酮康唑出峰酮康唑單一對(duì)映體的對(duì)照品很難獲得,迄今未見(jiàn)對(duì)酮康唑?qū)τ丑w進(jìn)行定性的相關(guān)研究報(bào)道。本文分別收集兩個(gè)對(duì)映體峰的流出液,測(cè)定其旋光方向,測(cè)得先后兩峰流出液分別呈左旋和右旋,即(-)-2S,4R-酮康唑先于(+)-2R,4S-酮康唑出峰。原因可能為流動(dòng)相中的磺丁基-β-環(huán)糊精是由7個(gè)D(+)吡喃型葡萄糖殘基經(jīng)α-1,4-糖苷鍵結(jié)合并由磺丁基衍生化而形成的,根據(jù)“三點(diǎn)作用”分離理論,當(dāng)它和右旋酮康唑相互作用時(shí),右旋酮康唑的苯環(huán)、氧原子和哌嗪基分別和磺丁基-β-環(huán)糊精的空腔、羥基和磺丁基相互匹配,形成比較穩(wěn)定的包結(jié)物,而左旋酮康唑無(wú)論怎樣旋轉(zhuǎn),最多有兩個(gè)基團(tuán)可以和磺丁基-β-環(huán)糊精相應(yīng)的基團(tuán)相互作用