蛋白裂解液之歐陽術創(chuàng)編

歐陽術創(chuàng)編 歐陽術創(chuàng)編 2021.02.02 歐陽美創(chuàng)編2021.02.02歐陽術創(chuàng)編 歐陽術創(chuàng)編 2021.02.02 歐陽美創(chuàng)編2021.02.02蛋白質的定位與蛋白質裂解液的選全細胞：NP-40或RIPA細胞質（可溶）：Tris-HCl細胞質（細胞骨架）：Tris-TritonS11：NP-40或RIPA細胞核：RIPA時間：2021.02.02線粒體：時間：2021.02.02創(chuàng)作：歐陽術RIPA裂解液配方

lmlRIPAbuffercontains35(11proteinaseiiihibitorandlOglphosphataseinhibitorRIPAbuffer最終濃度IMTris-HCl(pH7.5)5ml50mMNaCl0.87g0.15MNa-deoxycholaleO.lg(0.1%)0.5MEDTA(pH8.0)0.8mlNaF41mgNonidetP401ml(1%)AprotmmlOpg/pllOOyl10pg/mlM水到100mlAprotininlOgg/gl;用lOmMHEPES-KOH(PH8.0)溶解，備用。.NonidetP-40簡稱NP-40,乙基苯基聚乙二醇，常用非離子性去垢劑。?Na-deoxycholale,flj氧皿酸鈉，離子型去垢劑。離子型去垢劑主要作用有：裂解細胞；潘解蛋白，尤其是可以洛解一些難溶于水的蛋白，如膜蛋白等；很適合做WB，但在Co-IP中使用，需要謹慎。?覚抑§Jft(Leupeptin)：抑制絲氨酸蛋白酶包括唳蛋白陽、纖溶酶、猜胰激肽原1)fn半胱氮酸蛋白陽(包括木瓜蛋白陽和組級蛋白1B)?抑肽素A(PepstatinA)抑制各種天門冬氨酸蛋白萌，例如組級蛋白MD.腎素、胃蛋白繭、細菌天門冬氨酸蛋白1HIV蛋0K；?庚凝乳蛋白爾抑制劑(Chymostatin)JJ制具有糜蛋白萌類特異性絲氨酸蛋白爾(包括糜蛋白萌、胃促嗾爾、組級蛋白iG)fn大多數絲氨酸蛋白?(0括組級蛋白iB,H,L)?抗木瓜蛋白i(Antipain)制木瓜蛋白爾、胰蛋白酶和纖溶酶。?氟化鋼抑制酸性磷酸菌?正亂酸鈉：抑制做性確酸酶和酩氨酸磷酸爾(tyrosinephosphatase)?焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)：抑制絲氨酸■蘇氨酸磷戲陽(serine-threoninephosphatase)o在與蛋白相關的檢測中，首先最關鍵的一步便是蛋白質的提取。蛋白質的提取過程中，我們要經常抽和蛋白陽抑制劑以肪止蛋白質的降解。另外在確酸化蛋白的研究過程中，磷酸爾抑制劑也是必不可少的，本文總結了常用的蛋白萌抑制劑PMSF,Leupeptin亮肽素,Aprotinin抑肽繭，Pepstatin胃蛋白爾抑制劑，EDTA-Na2等以及磷iiffl制劑NaF氟化鈉，Na3VO4原磯酸鋼，BETA-glycerophosphate甘油磷酸樹，Na2P2O4焦確酸鈉等。對這些蛋白陽抑制劑的潘解配制，貯存液與工作液濃度，保存都做了詳細的說明。蛋白陽抑制劑PMSF:特性：絲氨酸蛋白爾抑制劑，如唳凝乳蛋白陽，唳蛋白I,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酣(可逆的地面處理)。溶解性：溶于異丙醇,乙醇，甲醇和丙二醇果〉10mg/mlo在水溶液中不穩(wěn)定。在100%異丙醇，+25°C時穩(wěn)定至少9個月分子量:174.2使用：貯存濃度:200mM,工作濃度：ImMLeupeptin亮肽素特性：抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白爾如唳蛋白酶，木瓜蛋白爾，纖li,和組級蛋白8IB溶解性：高度溶于水(lmg/ml)O4°C一周穩(wěn)定，分成爪份冷凍在?2(TC至少6個月分子量:C20H38N6O4x1/2H2SO4:475.6C20H38N6O4x1/2H2SO4xH2O:493.6使用：貯存濃M:1mg/ml,工作濃度0.5ug/ml(ImM)Aprotinin抑肽陽特性：絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制纖維蛋白激嗾蛋白81,糜蛋白爾的高活性。不抑制iti或因子x。溶解性：易溶于水(10mg/ml)或緩沖液(例如,tris,0.1M,pH8.0)opH約7?8的溶的在4C可保存1周，分裝保存在?2(TC可至少保存6個月。避免反復凍融,pH>12.8的礦性壞境可使其滅活。分子量:6,512使用：貯存濃度：lmg/ml,工作濃度：0.06-2.0ug/ml(0.01-0.3uM)Pepstatin胃蛋白H抑制劑特性：抑制天冬氨酸(酸)蛋白陽如胃蛋白爾，腎素，組級蛋白HD,凝乳H,許多微生物酸性蛋白酶溶解性：潘干甲醇約lmg/ml;可溶于乙醇，過夜溶解可達到1mg/ml;在6當量乙酸中洛解度為300ug/mlo4“C穩(wěn)定一周，分裝儲存于?20°C時可保存1個月分子量:685.9使用：貯存濃度：lmg/ml,使用濃度：0.7|.ig/ml(lpM)EDTA-Na2特性:金屬蛋白M抑制劑溶解性：溶干水至0.5M,在pH8-9的條件下，4￡穩(wěn)定至少6個月分子量：372.24使用：工作濃度：0.2-0.5mg/ml(O.5-1.3mM),不需現用現配，在溶液pH值調至8-9W再加入。磷酸陽抑制劑NaF氟化鈿溶解牲：溶于水分子量：41.99使用：膽存液：5M工作濃度：10?20mMNa3V04原訊酸鋼分子量:183.91落解性：溶于水，我們咧買過來的是原磯酸鈿.原磯酸鈿需要經過處理以后才能成為激活的磯嚴鈉,激活的磯酸鈉才具有抑制去確酸化的作用.原iHKifi變成激活的磯酸鈿的過程是：lOOmM原訊酸鈉激活儲存液配制.10.183克的原磯酸鈿落解于10ml的雙蒸水中，加酸調節(jié)PH至10(顧色變黃).煮至無色.室溫冷卻.重調PH至10重復(1)(2)(3)(4)直至落液保持無色，并且PH穩(wěn)定于10冷裝100ul/管，每10ml裂解液加一管.(終濃度為lmM),-20度保存.使用：存液：lOOmM工作濃度：1mMBETA-glycerophosphate甘油確酸鈉溶解性：溶于水分子量:306.11使用：貯存100mM工作濃度：25mMNa2P2O4焦確酸鈉溶解性:溶于水分子量：265.9貯存液:100mM,工作濃度：l?2mMSDS,NP-40,TritonX-100這三種去垢劑的作用是不同的，或者說作用力量強弱不同。SDS屬于離子型去垢劑，最厲害，基本可以把細胞完全破掉，DNA會釋放出來，裂解液變得很粘稠。NP?40是很富和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜,而對核膜破壞的作用弱，結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40,也是常用的細胞裂解液成分之一，在保護蛋白活性方面有一定作用(SDS基本會使蛋白變牲失活)。BrijBufferI

Tris-HC1(1M.pH7.5)1millilitre(ml)EDTA(0.5M)0.4millilitre(ml)NaC