植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進展

植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進展

1植物無性系組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用通常，在生產(chǎn)中，幼苗通常通過繁殖、種子繁殖、修剪、移植或埋葬枝條和生根來繁殖，但這些方法不同。比如苧麻是多年生植物,目前生產(chǎn)上多用分蔸繁殖法或種子繁殖法。分蔸繁殖,繁殖系數(shù)低,速度慢,種子繁殖則容易發(fā)生變異。Musabalbisiana是商品香蕉的1個野生親緣物種,其種子在自然條件下不能萌發(fā)。我國特有的毛白楊(populustomentosaCarr),插枝生根比較困難,扦插繁殖成活率不穩(wěn)定,常采用嫁接或埋條、埋根等方法進行無性繁殖,用材多,成活率亦低。菊花(Dendranthemamorifolium),傳統(tǒng)生產(chǎn)上是采用大芽扦插繁殖,但一些名貴品種不宜生根,致使生長弱,開花晚,無法大量繁殖生產(chǎn)以滿足多方面的需要。菠蘿[Ananascomosus(L.)Merr]的自然繁殖系數(shù)僅有2~3倍,用老莖切片繁殖法的繁殖系數(shù)也只能提高15倍,因此影響了良種的繁殖與推廣。1958年,Steward和Reinert在胡蘿卜愈傷組織和細胞培養(yǎng)實驗中獲得了植株,科學(xué)地證實“植物細胞的全能性”,為植物組織培養(yǎng)技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。經(jīng)過30多年的實驗研究,目前已有600多種植物能用組織培養(yǎng)方法形成芽、胚狀體及完整的植株。在離體培養(yǎng)下植物細胞所具有的這種能重新形成新個體的“全能性”,使組織培養(yǎng)技術(shù)在保持優(yōu)良種質(zhì),加速植物的無性繁殖等應(yīng)用中,取得了越來越多的成功,是快速繁殖優(yōu)良植株的捷徑。自20世紀60年代法國Morel開始用組織培養(yǎng)進行蘭花的無性繁殖以來,用組織培養(yǎng)進行無性繁殖已在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用。我國廣西欽州地區(qū)由雷林1號桉(EucalyptusleizhouNo.1)優(yōu)樹獲得的試管植物已開始用于造林;馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)的無毒苗已大面積栽種;已用組織培養(yǎng)方法迅速繁殖北美紅杉(Sequoiasempervirens(Lamb.)Endl.)。植物無性系的無菌快速繁殖發(fā)展如此迅速緣于以下優(yōu)點:(1)可以保持植物的優(yōu)良特性和性狀。由于大多數(shù)果樹和觀賞植物都是高度雜合的,因此它們的種子后代不可能與原種完全相同。只有無性系產(chǎn)生的植株,在遺傳上才能與親本植物完全相同,從而使品種的特性代代相傳。一個品種通過無性繁殖可產(chǎn)生在遺傳上等同的多個拷貝,其中由一個個體通過無性繁殖產(chǎn)生的一個群體稱為一個無性系。在自然界中,無性繁殖的途徑有二,一是無融合生殖,即不經(jīng)過減數(shù)分裂和受精而形成種子:二是營養(yǎng)繁殖,即由母株的營養(yǎng)部分再生出新的植株。無融合生殖只發(fā)生在少數(shù)幾個物種,因此園藝家一直采用營養(yǎng)繁殖的方法對入選品種進行無性繁殖,從而保持植物的優(yōu)良性狀。對于很少產(chǎn)生或不產(chǎn)生有生活力的種子,營養(yǎng)繁殖是唯一的繁殖方法。而組織培養(yǎng)技術(shù),作為植物營養(yǎng)繁殖的一個新手段已被廣泛應(yīng)用。(2)用組織培養(yǎng)法進行繁殖周期短,繁殖快,節(jié)省空間。當前微繁最主要的用途是替代傳統(tǒng)的營養(yǎng)繁殖方法以增加繁殖系數(shù)。而在離體條件下繁殖系數(shù)的提高,必然會顯著縮短一個新品種由選育到推廣所需的時間。如通過組織培養(yǎng),由一塊很小的,甚至是極微的植物組織,在12個月之內(nèi)可以產(chǎn)生100萬以上植株,如此高的繁殖速度是任何傳統(tǒng)的無性繁殖方法所不能達到的。枝條的增殖周期很短(14~42d),而每個周期都能導(dǎo)致枝條數(shù)的幾何級數(shù)增長。澳洲青蘋(Maluspumila)離體培養(yǎng)時,由1個莖尖可以在8個月內(nèi)繁殖60000個以上蘋果枝條。對于蘭科植物來說,微繁是惟一有效的進行大規(guī)模無性繁殖的方法。此外,在組織培養(yǎng)中,植物的繁殖可以不受季節(jié)的影響,周年連續(xù)進行。(3)可以通過組織培養(yǎng)的手段獲得無病原菌的或無病毒的植株。消除病害的問題在經(jīng)濟樹種、花卉生產(chǎn)上很受重視,因為大多數(shù)苗木連續(xù)采用扦插或嫁接等方法進行無性繁殖,體內(nèi)病毒有所積累,嚴重地影響了果樹的生長發(fā)育,甚至導(dǎo)致毀滅性的災(zāi)害而影響苗木生產(chǎn)的發(fā)展。一般都應(yīng)用熱處理法獲得無病毒植物,但此法的主要限制在于并非所有供試植物都對熱處理敏感,而且在熱處理之后只有一小部分植株能夠存活。莖尖培養(yǎng)方法具有更廣泛的應(yīng)用,在應(yīng)用組織培養(yǎng)方法以獲得無病毒植物時,所用的外植體是莖尖或頂端分生組織,這是因為病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的,在受浸染的植株中莖尖或頂端分生組織一般無毒或者只攜帶濃度很低的病毒。在無菌條件下仔細地剝出莖尖,然后在合適的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),一般可由莖尖再生出無病毒的植株。通過這種方法已得到的無病毒植株有草莓(FragariaananassaDuch),馬鈴薯,香石竹(DianthuscargophyllasL.)等。2植物快速繁殖的類型利用組織培養(yǎng)進行無性繁殖大約可以經(jīng)下列5種途徑達到大量繁殖的目的。2.1知識產(chǎn)權(quán)法扦插產(chǎn)生無性系無根苗這是用組織培養(yǎng)方法進行無性繁殖方面應(yīng)用最廣的方法。腋芽存在于每個葉片的葉腋中,每個腋芽都有發(fā)育成1個枝條的潛力。采用一個有活力的潛伏芽在無菌條件下扦插,使其長出腋芽或叢生芽,這些腋芽又可以直接發(fā)育成枝條,這個過程可以重復(fù)若干次,結(jié)果原來的外植體就變成了一叢新枝。例如苧麻,將無菌苗剪取帶1~2個的節(jié)段在含激素的MS培養(yǎng)基上,幾天后腋芽萌動,這些腋芽的基部又很快長出新的腋芽,大約45d左右,每瓶就可產(chǎn)生10~20株新苗,如再用作接種材料,反復(fù)切取帶腋芽的莖段再培養(yǎng)繁殖,就可以得到大量的無性系無根苗。這樣一年的繁殖倍數(shù)可以高達108之多。2.2產(chǎn)生的疾病指從愈傷組織表面或內(nèi)部形成芽和根。(1)接種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)一般的方法是將莖切成約0.3~0.5cm長的莖段,接種到合適的培養(yǎng)基上。例如雞蛋棗,10d左右就可產(chǎn)生愈傷組織,20d后就能分化出芽,芽的數(shù)目1~3個不等,多的可達10個。分化率最高可達40%~50%。(2)低溫切子法cm利用葉外植體愈傷組織產(chǎn)生不定芽的方法比切段繁殖法有更高的繁殖速度。例如,將毛白楊的葉切成1cm×1cm的切塊,在合適的培養(yǎng)基上,使葉背面和培養(yǎng)基相接觸,約15d后,從葉的切口處先形成愈傷組織,經(jīng)30d左右分化出不定芽,之后逐漸形成一簇。每個葉外植體可以得到20個以上嫩枝。粗略計算,1株毛白楊,如果切取5個外植體,至少可得到50株以上由不定芽長成的小苗。用這個方法比莖切段繁殖法提高繁殖速度10倍以上。2.3體團增殖培養(yǎng)胚狀體是指培養(yǎng)過程中由外植體或愈傷組織產(chǎn)生的與正常受精卵發(fā)育方式類似的胚胎結(jié)構(gòu)。胚狀體途徑產(chǎn)生再生植株的主要特點是:分化率高,繁殖系數(shù)大,根系發(fā)達。例如東方旱麥草[Eremopyrumorientale(Linn.)Jaub.etSpach],可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體進行繁殖,操作上需進行多次轉(zhuǎn)移培養(yǎng),將不同顏色、不同結(jié)構(gòu)的愈傷組織分別進行培養(yǎng),并挑出肉眼可見的胚狀體團繼代培養(yǎng),一般繼代培養(yǎng)20~30d,胚狀體團大小為1~3cm3,可以切成10~30塊進行下一代繼代培養(yǎng),由于胚狀體按10~30倍的幾何級數(shù)增殖,1a內(nèi)就可獲得胚狀團1012~3012塊,每塊成苗10~20株,就可獲得胚狀體苗1013~20×3013株。因為這些苗在發(fā)育上是不同步的,成活率僅為5%,1a也可以培養(yǎng)出1013株以上的胚狀體苗。2.4原球莖的增殖原球莖的形成過程是:當對植物離體莖尖進行培養(yǎng)時,它們不是長成帶葉的枝條,而是形成一個扁球體,基部著生假根,這些結(jié)構(gòu)就叫原球莖。它們在形態(tài)上與種子萌發(fā)時由胚形成的原球莖相似。在莖尖培養(yǎng)中,這種原球莖起源于葉片的表皮或下表皮細胞。某些原球莖還能進行增殖,形成原球莖叢,其中最多可包含十幾個原球莖。周麗等在大花蕙蘭(Cymbidiumhybridium)進行無性繁殖試驗時,把每個原球莖切成3~6塊,接種在合適的培養(yǎng)基上,由于其表面細胞的活動,每一塊又形成若干新的原球莖。在40~50d的時間內(nèi),由1個切塊最多能產(chǎn)生12個原球莖。這種增殖原球莖的過程可以無限反復(fù)進行?？偲饋硭?若由1個莖芽在大約2個月的時間內(nèi)形成3~5個原球莖,把每個原球莖切成4~6塊,其中每一塊在1個月內(nèi)又產(chǎn)生3~5個原球莖,以這樣一種繁殖速度,在1a中可以產(chǎn)生幾百萬個植株。2.5直接換能器指由離體的莖尖、花芽、葉片、花絲、花托、鱗片等組織上直接產(chǎn)生小植株。這種方式往往在形成小芽苗的同時或之前也形成少量的愈傷組織。(1)用新莖芽培養(yǎng)新莖如林如青等建立了甜葉懸鉤子(RubussuavissimusS.Lee)的莖尖培養(yǎng)方法:把剪下的1mm長的莖尖(帶有2~3個葉原基)切成約20段,置于培養(yǎng)基上以后,每段都能形成很多新莖芽,有些新莖芽60d后長到大約3cm高。把這些莖叢從基部分割開來再培養(yǎng),又可以產(chǎn)生更多的新莖。這個過程每10~14d重復(fù)1次,這樣在3~4個月內(nèi),由1個莖尖開始即可產(chǎn)生8000個植株。(2)側(cè)芽分化和增殖將蘭州百合(Liliumdavidiivarunicolor)鱗片切段培養(yǎng)在含有1/2MS+IBA0.5mg/L的培養(yǎng)基上時,1株百合最多可以產(chǎn)生20個以上的小鱗莖。還有用側(cè)芽分化和增殖,如桑樹(MorusalbaL.)、甘蔗等。葉外植體的周圍再分化出芽的有銀河1號楊(Populusalba×P.hopeiensis)、菊花(Dendranthemagrandiflorum)等,與上述器官發(fā)生型繁殖方式不同的是:不定芽由植物葉片切口直接長出來,其間不間入愈傷組織階段。也有由萌發(fā)種子的頂芽及腋芽產(chǎn)生叢生芽,如黃山藥(DioscoreapanthaicaPrainetBurkill)、香石竹(Dianthuscaryophyllus)等,以上這些方式都能產(chǎn)生大量的試管苗。3組織培養(yǎng)法快速繁殖應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)進行植物離體快繁現(xiàn)已被世界上很多苗圃用于各種各樣的草本和木本植物,將蘭花、菊花等觀賞植物用組織培養(yǎng)方法進行工廠化生產(chǎn),將桉樹、楊樹等林木樹種用組織培養(yǎng)方法進行擴繁用于植樹造林。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,越來越多的外源基因被轉(zhuǎn)到植物中,將被轉(zhuǎn)基因的植物用組織培養(yǎng)方法進行擴繁是進行轉(zhuǎn)基因的第一個關(guān)鍵步驟,因此用組織培養(yǎng)法進行快速繁殖技術(shù)很重要,得到了更加廣泛的應(yīng)用。但是,目前這種離體無性繁殖方法也還存在一些問題,有一定的局限性。3.1離體繁殖技術(shù)雖然很多物種都已建立了進行離體快繁的有效、實用方法,但很多難于用傳統(tǒng)方法繁殖的重要樹木,包括若干裸子植物,離體繁殖技術(shù)還沒有過關(guān)。在不定芽形成和愈傷組織方法中,莖芽必須重新形成,而很多重要栽培植物并不能形成莖芽,那么是這些組織具有某種特殊的要求至今還沒得到滿足呢?還是它們?nèi)鄙偾o芽分化的遺傳能力?3.2愈傷組織的繁殖通過愈傷組織誘導(dǎo)芽是進行植物繁殖的最快方法,但用這種方法遇到了嚴重問題,例如,當通過愈傷組織培養(yǎng)繁殖石刁柏時,所得的植株表現(xiàn)多倍性和非整倍性,用胚狀體方式進行無性繁殖時也存在遺傳上變異的問題。用愈傷組織培