RNAi技術(shù)及其實(shí)驗(yàn)操作

ＲNAｉ技術(shù)及其實(shí)驗(yàn)操作點(diǎn)擊次數(shù)：252發(fā)布時(shí)間：2０１０－11－1414:04:０９RNAi技術(shù)及其實(shí)驗(yàn)操作目前對(duì)RNＡi（ＲNAinterfeｒencｅ）的定義有很多種，不同的資料對(duì)其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同，如果將ＲNAｉ看作一種生物學(xué)現(xiàn)象,可以有以下定義：①RNＡｉ是由ｄsＲＮA介導(dǎo)的由特定酶參加的特異性基因緘默現(xiàn)象，它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。②ＲNAi是有dsRNＡ參加指導(dǎo)的,以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因緘默現(xiàn)象.具有核苷酸序列特異性的自我防御機(jī)制,是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救肭趾?細(xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒RNＡ同源的基因發(fā)生共同基因緘默的現(xiàn)象.?如果將其作為一門生物技術(shù),則定義為:①RNＡi是指通過反義RNＡ與正鏈RNＡ形成雙鏈ＲNA特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象，它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA和反義RＮA）,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mＲNA降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。②RＮAｉ是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RＮA（dsＲNA)在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的mＲNA降解成２1ｎｔ～２3ｎt的小片段，使相應(yīng)的基因緘默。③RNＡi是將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的雙鏈RNA（dｓRNA)導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該mRNＡ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因緘默(poｓt-ｔraｎsｃripｔｉonalｇｅneｓileｎcｅ,ＰTＧＳ)。?各種不同定義雖然說法不同,但所描述事實(shí)是大體相同的，簡(jiǎn)潔地可以說，ＲNAi就是指由RNＡ介導(dǎo)的基因緘默現(xiàn)象。也就是說,ＲＮAi技術(shù)是利用ＲNＡi為原理，在體外利用化學(xué)或酶促合成ｓｉRNA，也可構(gòu)建在體內(nèi)合成sｉRNA的質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)載體,然后利用傳統(tǒng)微注射磷酸鈣法、電穿孔轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞從而致使靶基因緘默的技術(shù).RNA干擾有很多方法：①化學(xué)合成法：應(yīng)用最廣泛但成本昂貴，體外合成的長(zhǎng)21ｎt、3`端帶有2個(gè)游離核苷酸的siＲNA較其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的ｍRNＡ的效果.②siRNA表達(dá)載體:在質(zhì)?；虿《据d體中，利用ＲＮA聚合酶啟動(dòng)因子U６或T７分別掌握正義鏈和反義鏈的合成并退火形成雙鏈siRＮA,或在啟動(dòng)子下游設(shè)計(jì)帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的表達(dá)單位，自身退火形成雙鏈siRNA。③dsRNＡ表達(dá)載體:多用于果蠅、線蟲等低等生物,在體內(nèi)表達(dá)后被Ｄｉcｅｒ切割成21-23nｔ的siRNA;或在體外利用Ｄiceｒ、RNaseIII切割dｓRNＡ產(chǎn)生ｓiRＮA，純化后使用。?最近由于ＲＮＡ干擾（RＮAinteｒference,RNAi)的發(fā)現(xiàn)使反義領(lǐng)域的討論增多。這種自然發(fā)生的現(xiàn)象最早是在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的,是序列特異性地使轉(zhuǎn)錄后的基因緘默的有力機(jī)制。ＲNA干擾是由長(zhǎng)的雙鏈RＮＡ分子發(fā)動(dòng)的,該分子可以被Ｄicｅｒeｎzｙme加工成長(zhǎng)度為2１－２３個(gè)核苷酸的RNA。ＲNａseIII蛋白被認(rèn)為是作為一個(gè)二聚體發(fā)揮作用，它對(duì)雙鏈RNA的兩個(gè)鏈都進(jìn)行切割，酶切的產(chǎn)物３'末端相互重疊。然后這種小的干擾RNＡ分子(smallinteｒfｅrｉnｇRＮAs，siRNAs）摻入RNA誘導(dǎo)的緘默復(fù)合物（RＮＡ—inｄｕｃedｓiｌｅncinｇcomplｅx，RＩSC),引導(dǎo)核酸酶降解靶RＮA。

這種保守的生化機(jī)制可用于討論多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用受到阻礙，由于長(zhǎng)的雙鏈RNＡ分子會(huì)引起干擾素應(yīng)答。因此Ｔｕscｈi及其同事表明長(zhǎng)度為21nｔ的siRNA可以特異性的抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)是一個(gè)革命性的突破。這個(gè)發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大量利用RＮAi技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的討論,由于與傳統(tǒng)的反義技術(shù)比,ＲNＡi的性能明顯較高.?有趣的是，除了短雙鏈ＲNA，短發(fā)夾ＲNA(shｏrtｈａｉｒpinＲＮA，shＲNＡ),比如莖環(huán)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過加工后也可以變成siRNＡ，從而產(chǎn)生RＮＡ干擾。這使得構(gòu)建表達(dá)干擾ＲＮA的載體，從而使哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)長(zhǎng)期緘默成為可能。shRNA可以利用ＲNA聚核酶ＩII啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，在正常情況下,該啟動(dòng)子是掌握小核ＲNＡ（smalｌnｕclearRＮA,sｎRNA）U6或者RNａｓeＰ的組分Ｈ1ＲNA轉(zhuǎn)錄的.另外一種方法是兩段短RNA分子分別用U６啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出來。載體介導(dǎo)的ｓｉRNＡ表達(dá)使對(duì)功能缺失(loｓｓ—of-ｆunｃtiｏｎ)表型進(jìn)行長(zhǎng)期分析成為可能。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi),兩個(gè)月后仍可觀察到緘默現(xiàn)象。

另外一種延長(zhǎng)siRＮA抑制基因表達(dá)時(shí)間的方法是對(duì)化學(xué)合成的RＮA進(jìn)行核苷酸修飾.盡管未經(jīng)修飾的短雙鏈RＮＡ在細(xì)胞培育物或者體內(nèi)的穩(wěn)定性出乎意料的高,然而有些情況下，需要對(duì)siRＮＡ的穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步提高。因此,可以在兩條鏈的末端都引入經(jīng)過修飾的核苷。一個(gè)５＇端為兩個(gè)2’-O－甲基RNA、３’端為４個(gè)甲基化核苷的ｓiRNA與序列相同但是未經(jīng)修飾的siRNA比活性相同，但是在細(xì)胞培育物中引起的基因緘默現(xiàn)象的時(shí)間延長(zhǎng).然而，增多siＲNA中的甲基化核苷,或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導(dǎo)致siＲNＡ活性下降。?RNA干擾在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的第一個(gè)討論是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個(gè)編碼shRＮA的質(zhì)粒注入老鼠的尾靜脈。在大多數(shù)器官中,報(bào)道基因（編碼于共轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)基因小鼠上)的表達(dá)可以被有效地抑制。另外,Fａｓ基因被作為肝損傷治療相關(guān)的內(nèi)源靶標(biāo)進(jìn)行了ＲNA干擾實(shí)驗(yàn)。注射sｉRNA之后,小鼠肝細(xì)胞中的FasmRＮＡ和蛋白水平下降了10天。把Fas基因緘默可以保護(hù)小鼠免遭由注射競(jìng)爭(zhēng)性Ｆas特異抗體引起的爆發(fā)性肝炎，８2％用ｓｉRＮA處理的小鼠活過了1０天觀察期，而全部的對(duì)比小鼠在3天之內(nèi)死亡。?上述討論中采納的高壓導(dǎo)入技術(shù)是一種粗暴的方法，不適于治療用。因此,標(biāo)準(zhǔn)的基因治療所采納的方法被用于RＮA干擾。一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒載體被用于導(dǎo)入ｓiRＮA，以抑制人類胰腺腫瘤細(xì)胞中的癌基因Ｋ－ｒａｓ等位基因。負(fù)調(diào)控癌細(xì)胞中K-ｒａｓ基因的表達(dá)使得它們?cè)谧⑷霟o胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項(xiàng)討論還表明ｓｉRＮA的高度特異性，由于只有癌基因K—ras被緘默，而與之只有1個(gè)堿基對(duì)差異的野生型等位基因并沒有被緘默。另外，當(dāng)在紋狀區(qū)注射表達(dá)sｉRＮＡ的腺病毒之后，轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中GFＰ基因的表達(dá)可以被抑制.β－葡萄糖醛酸苷酶（ｂ-gｌｕｃorｏｎｉdasｅ）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制.有趣的是,具有CMV啟動(dòng)子和最小的pｏlyA尾的RＮA聚合酶ＩI表達(dá)元件被用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，為設(shè)計(jì)組織特異性或者可誘導(dǎo)的ｓｉRNA載體打開了大門.?總的來說，siRNA的第一個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行,其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標(biāo)開展討論.至今為止的討論沒有觀察到任何應(yīng)用ｓiＲNA引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗(yàn)開頭之前仍需當(dāng)心，以排解長(zhǎng)期使用RNA干擾引起的嚴(yán)重副作用。由于用ｓｉRNA使基因表達(dá)緘默與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相像,討論者將從十多年來反義技術(shù)討論的教訓(xùn)中獲益,比如需要使用合適的對(duì)比以證明基因表達(dá)的敲除是特異性的,以及對(duì)免疫系統(tǒng)可能引起的意外影響進(jìn)行簡(jiǎn)略分析。?經(jīng)過長(zhǎng)期盛衰沉浮,反義技術(shù)近年來得到越來越多的注意。對(duì)能夠提高靶表親和性和生物穩(wěn)定性、降低毒性的修飾核苷的討論取得了重要進(jìn)展.由于大多數(shù)新的DNA類似物不能激活RNasｅH，對(duì)反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)需要考慮靶mRNA是否需要保留,例如，是轉(zhuǎn)變剪接方式，還是降解靶mRＮＡ(這種情況下應(yīng)該使用gapmer技術(shù)).可以通過有系統(tǒng)的修飾天然核酶或者通過體外選擇技術(shù)獲得具有高催化活性的穩(wěn)定核酶.一些反義寡核苷酸和核酶已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)討論,一個(gè)反義藥物已經(jīng)在199８年獲得批準(zhǔn)。一個(gè)重要的突破是發(fā)現(xiàn)短的雙鏈ＲNA分子可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特異性緘默基因表達(dá)。這個(gè)方法與傳統(tǒng)的反義技術(shù)比效率明顯更高，并且一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表。因此，反義技術(shù)有望廣泛應(yīng)用于對(duì)未知功能基因的討論、藥物靶標(biāo)的確認(rèn)和治療。

ＲNAi的發(fā)現(xiàn)ＲNA干擾(RNAｉnｔｅｒfeｒence,RＮAｉ)現(xiàn)象是一種進(jìn)化上保守的抵擋轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ｍＲNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈ＲＮＡ（dｏublestrａnｄＲNA,dsRＮA)導(dǎo)入細(xì)胞后,能特異性地降解該mＲＮA,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,這一過程屬于轉(zhuǎn)錄后基因緘默機(jī)制（ｐoｓttranｓcripｔioｎalｇeｎｅｓilｉｅnｃｉng,PＴGS)范疇.ＲＮAｉ廣泛存在于生物界，從低等原核生物,到植物，真菌，無脊椎動(dòng)物,甚至近來在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象,只是機(jī)制也更為簡(jiǎn)潔.?早在199０年進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物有關(guān)討論時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，將全長(zhǎng)或部分基因?qū)胫参锛?xì)胞后某些內(nèi)源性基因不能表達(dá),但這些基因的轉(zhuǎn)錄并無任何影響，并將這種現(xiàn)象稱為基因轉(zhuǎn)錄后緘默（poｓttrａnｓｃriptｉｏnaｌgｅｎeｓilｅｎcｉnｇ,PTＧS).１996年在脈孢菌屬（Neｕroｓporａ）中發(fā)現(xiàn)了相像現(xiàn)象,只不過將這種現(xiàn)象命名為基因表達(dá)的阻抑作用（ｑuｅlｌiｎg)．首次發(fā)現(xiàn)ｄsRNA能夠?qū)е禄蚓}默的線索來源于線蟲Cａenorhaｂdｉtｉseleｇanｓ的討論。１9９5年康乃爾高校的討論人員Ｇuｏ和Kemphueｓ嘗試用反義RＮＡ去阻斷par—1基因的表達(dá)以探討該基因的功能，結(jié)果反義RNA的確能夠阻斷ｐar21基因的表達(dá)，但是奇怪的是,注入正義鏈RNA作為對(duì)比，也同樣阻斷了基因的表達(dá)。這個(gè)奇怪的現(xiàn)象直到3年后才被解開——華盛頓卡耐基討論院的ＡｎdｒewFire和馬薩諸塞高校癌癥中心的ＣｒaｉｇMelｌo首次將雙鏈dsRＮA——正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲，結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因緘默。實(shí)際上每個(gè)細(xì)胞只要很少幾個(gè)分子的雙鏈RNA已經(jīng)足夠完全阻斷同源基因的表達(dá).后來的實(shí)驗(yàn)表明在線蟲中注入雙鏈ＲNＡ不單可以阻斷整個(gè)線蟲的同源基因表達(dá)，還會(huì)導(dǎo)致其第一代子代的同源基因緘默。他們將這種現(xiàn)象稱為ＲＮA干擾。?過去認(rèn)為，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在RＮＡｉ現(xiàn)象，由于較長(zhǎng)的dsRＮA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能誘導(dǎo)IFN(干擾素)生成,并激活ＳTＡＴ途徑參加的PKＲ(dsRＮA依靠性激酶)的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)ｄsRNA本身與PKＲ結(jié)合也能令其激活,繼而磷酸化翻譯起始因子ｅIＦ２a使之失活，導(dǎo)致非特異性的蛋白質(zhì)合成障礙；另一方面,ｄsRNA又能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白的2′，5′腺苷合成酶，生成2′，5′腺苷酸，激活非特異性的RＮA酶L，發(fā)生非特異性的RNA降解效應(yīng)。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn),只要ｄsＲNA短于30ｂp，就不會(huì)促發(fā)干擾素效應(yīng),同時(shí)又能特異性地降解mRNＡ，引起基因緘默,說明ｄｓRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也能發(fā)揮肯定作用,為以后的基因治療等RNAi應(yīng)用領(lǐng)域供應(yīng)了新的討論方向。?ＲＮAi的簡(jiǎn)略機(jī)制和過程還不十分清楚,目前大致分為以下幾個(gè)階段進(jìn)行:①siＲNA的形成階段:此階段需要Rde-1,Rdｅ－4和ｄsＲＮＡ特異性的核酸內(nèi)切酶Dｉcer等共同參加。Ｒdｅ-1，4編碼的蛋白識(shí)別外源dsRNＡ,引導(dǎo)dsRＮＡ與Dicer結(jié)合，然后，Dicｅr將dsＲNＡ解旋,再將其裂解為21—2５nt大小的小干擾RNＡ(smallinｔerｆerｉｎgRNＡ，ｓiRNA）.Dｉｃeｒ定位于胞漿中，但核內(nèi)ｍRＮＡ剪切修飾后在向核外運(yùn)輸過程中也存在RＮAｉ現(xiàn)象，可能有其他類似功能的酶發(fā)揮作用。現(xiàn)認(rèn)為２1-２５nt大小并在3′端帶有2—3個(gè)堿基懸端且5′端磷酸化的siRＮA誘導(dǎo)的RNＡi效應(yīng)最強(qiáng)。Dｉcer家族在進(jìn)化上格外保守,有5個(gè)組成部分:N-端RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、1個(gè)PＡZ結(jié)構(gòu)域（Ｐiwi，augonaute，Zwｉllｅ／piｎｅheaｄ，PＡＺ)、２個(gè)ＲNａseＩII結(jié)構(gòu)域和C端dsRＮＡ結(jié)合基序。Dicer在體內(nèi)一般是以二聚體的形式發(fā)揮作用的,由于不同種族Diceｒ分子大小不一樣，所以dsＲNA被切割成的siＲＮＡ大小具有種族差異。②RNA誘導(dǎo)的緘默復(fù)合物(ＲNA—ｉnducedsilｉcenciｎｇcoｍｐlｅｘ,RISC）形成階段:生成的siRＮA和RNAi特異性酶如AGＯ－２、MＵＴ-7、RED－1、PＡZ蛋白和ＤＮA－RNＡ螺旋酶結(jié)合形成ＲＩSC,具有序列特異性核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和解旋酶活性,能特異地降解與siRNA同源的靶ｍＲNA。③效應(yīng)階段:siRNA引導(dǎo)ＲＩSC與同源性的mRNA結(jié)合，在ＡTＰ及解旋酶(如qde-3,ｍuｔ－6，mｕt-14)的作用下使sｉRNＡ鏈解離，并使ＲIＳC由25０ｋＤ大小的前體形式變成約10０kD左右活性形式，同時(shí)解旋酶催化同源mRNＡ與sｉRＮA的正義鏈相互交換，核酸酶在mRＮA與反義RNＡ所形成的雙鏈區(qū)的5′起始端下游7—１０個(gè)核苷酸處切斷ｍRNA,起到特異的抑制基因表達(dá)的效果。④擴(kuò)增階段:該反應(yīng)以sｉRＮA中的一條鏈為引物，以靶mＲＮA為摸板，在RNA依靠的ＲNA聚合酶（RNA-ｄepｅndeｎｔRNAｐｏlｙｍerａsｅ，RdRP)作用下，擴(kuò)增靶mRＮA,產(chǎn)生新的二級(jí)sｉＲNA，而這些siRＮA又能連續(xù)反作用于靶mRＮA。RdRP不僅能增加sｉRNA的拷貝數(shù)，而且能將特別的單鏈RNA轉(zhuǎn)變dsＲＮＡ。RdRP還是一個(gè)重要的“senｓor”，它能識(shí)別正常和特別的RNA。轉(zhuǎn)基因RNA和病毒RＮA都是在ＲdRP的識(shí)別下啟動(dòng)RＮＡi的反應(yīng)過程.此外,ＲNAi的擴(kuò)增效應(yīng)還可能存在另外兩種機(jī)制:①Diｃer將長(zhǎng)dｓＲNA切成初級(jí)siＲNＡ，這一放大水平取決于dsRNA的長(zhǎng)度;②siＲNＡ在酶的作用下可以多次應(yīng)用,產(chǎn)生進(jìn)一步的放大效應(yīng)。RNAｉ的作用機(jī)制干擾性小RNA(smａllinteｒfeｒingＲNＡ，或sｈorｔintｅrｆeｒiｎgＲＮＡs,ｓiＲNA）是RNA干擾作用（ＲNAｉ）賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子.ｓiRＮA是一類長(zhǎng)約2１～2５個(gè)核苷酸(nt)的特殊雙鏈RＮＡ(dｓRNA)分子，具有特征性結(jié)構(gòu)，即ｓｉＲNA的序列與所作用的靶ｍＲNA序列具有同源性;ｓiRNA兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基.此外，每條單鏈的3′端均有２～3個(gè)突出的非配對(duì)的堿基RＮAi的主要過程是，dsRNA被核酸酶切割成2１~2５nt的干擾性小RNＡ（siRNA），由siRNA介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶ｍRNＡ分子．細(xì)胞中ｄｓRNA的形成是RNAｉ的第一步．細(xì)胞中dsRＮA可通過多種途徑形成，如基因組中ＤＮA反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；同時(shí)轉(zhuǎn)錄反義和正義ＲNA;病毒RNＡ復(fù)制中間體;以及以細(xì)胞中單鏈RＮＡ為模板由細(xì)胞或病毒的ＲNA依靠RNA聚合酶（RdＲp)催化合成dsRNＡ等．在線蟲（C．elｅgans）可以直接注射dsＲNA或把線蟲浸泡在含ｄsRＮA溶液中等方式引入外源ｄsＲNＡ，還可以通過喂養(yǎng)表達(dá)正義和反義RＮＡ的細(xì)菌獲得dsRNＡ。?現(xiàn)已初步闡明RNAｉ的作用機(jī)制。RＮＡi的第一步是，dsRNＡ在內(nèi)切核酸酶(一種具有RＮaｓeⅢ樣活性的核酸酶)作用下加工裂解形成21～２５nｔ的由正義和反義序列組成的干擾性小dｓRNＡ，即siRNＡ。果蠅中ＲNaｓｅIＩI樣核酸酶稱為Dicer.Dｉcｅｒ含有解旋酶（ｈeｌｉｃａse)活性以及dｓＲNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。已發(fā)現(xiàn)在Arabiｄopｓｉｓ,C.ｅlｅgans，Schizosａccharｏmycespombe以及哺乳動(dòng)物中也存在Dｉｃeｒ同類物。RNAi的其次步是,由siＲNA中的反義鏈指導(dǎo)形成一種核蛋白體，該核蛋白體稱為RＮA誘導(dǎo)的緘默復(fù)合體（ＲNAindｕcedsilｅｎcｉnｇcｏmｐｌex，RISC），由RIＳＣ介導(dǎo)切割靶mＲNA分子中與ｓｉＲＮA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域,從而達(dá)到干擾基因表達(dá)作用．RＩSC由多種蛋白成分組成，包括內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RＮＡ鏈搜尋活性等。線蟲Ｃ．elegaｎs中的MUT7(一種RＮaｓｅＤ樣蛋白）可能是一種3′5′外切核酸酶。此外，PＡZPＰiｗｉ蛋白家族成員可能是ＲISC中的構(gòu)成組分，如Araｂiｄｐｏsiｓ中的ＡGO１;N.Cｒasｓa中的QDE；C。ｅｌeｇaｎs中的ＲDE１等，以上這些蛋白與翻譯因子eIF2C同源．?討論進(jìn)一步揭示,ATP在siRＮＡ介導(dǎo)的RNAi中具有重要作用.較長(zhǎng)ｄｓRNA向sｉRＮA的轉(zhuǎn)變要有ＡTＰ參加.ｓiＲNＡ與蛋白因子形成一個(gè)無活性的約36０kD的蛋白PＲＮA復(fù)合體;隨之，sｉＲNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋并形成有活性的蛋白PRＮA復(fù)合體（RISＣ)，此步具有ＡTＰ依靠性.ＲISC活性復(fù)合體對(duì)靶ｍＲNＡ的識(shí)別和切割作用,這一步可能不需AＴP參加。?此外,ATP使siRNA5′端帶上磷酸分子,且對(duì)siRNA的功能具有重要作用。上述過程中sｉRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋很可能是一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，由于sｉRＮＡ雙鏈體與細(xì)胞裂解物、ATP等孵育后再除去AＴP及其它幫助因子,含有ｓiRNA的活性復(fù)合體仍能識(shí)別和切割靶ｍRNＡ分子?ｓiＲＮA可作為一種特殊引物，在RＮA依靠RNA聚合酶(RdRp）作用下以靶mRNＡ為模板合成ｄｓRNＡ，后者可被降解形成新的sｉＲNA；新生成的siRＮＡ又可進(jìn)入上述循環(huán)。這種過程稱為隨機(jī)降解性多聚酶鏈反應(yīng)（ｒanｄomdegradaｔｉveＰCＲ）．新生的dsRＮA反復(fù)合成和降解，不斷產(chǎn)生新的sｉRＮＡ，從而使靶ｍＲNA漸進(jìn)性削減,呈現(xiàn)基因緘默現(xiàn)象．RdRｐ一般只對(duì)所表達(dá)的靶mRＮＡ發(fā)揮作用,這種在ＲＮAi過程中對(duì)靶ｍRNA的特異性擴(kuò)增作用有助于增強(qiáng)RNAi的特異性基因監(jiān)視功能．每個(gè)細(xì)胞只需要少量dｓRＮＡ即能完全關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá),可見RNAi過程具有生物催化反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)特征．?ｍiＲＮA與sｉＲNA的區(qū)分：

（1)ｍiRＮA是單鏈的，而siＲNA則是雙鏈的；?（２)ｍiRＮA參加正常情況下生長(zhǎng)發(fā)育基因調(diào)控,而ｓｉRＮＡ不參加動(dòng)物體的正常生長(zhǎng),只有在病毒或其它dｓRNA誘導(dǎo)情況下才產(chǎn)生siRNA，作為mｉRNA的完善和補(bǔ)充；?（3）mｉＲNＡ在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，推測(cè)在翻譯水平也起作用，而ｓｉＲＮA為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)調(diào)控;?（４）Ｄｉcer酶對(duì)兩類RNＡ的加工過程,miRNA為不對(duì)稱性，僅來自含莖－環(huán)結(jié)構(gòu)RNＡ前體的一側(cè)臂，剩余部分很快降解,而這種不對(duì)稱性不存在于而siＲNA加工過程中。RＮAｉ的特點(diǎn)①高度特異性:有時(shí)siRNA一個(gè)堿基轉(zhuǎn)變就會(huì)大大降低封閉靶基因的效果.Bｒumｍｅlkamp［4］等利用載體表達(dá)的小發(fā)夾RNA(smallhａiｒｐｉｎRNA，ｓhRNA）來封閉人MＣF-７細(xì)胞的CDH1基因，shＲＮA上僅一對(duì)堿基的突變就不能抑制CDH1基因的表達(dá)。其中siＲNＡ的中央位置堿基位點(diǎn)和3′末端倒數(shù)其次個(gè)堿基起了格外重要的作用.?②高效率：在細(xì)胞內(nèi)ＲNAi途徑一旦被啟動(dòng)，反應(yīng)信號(hào)就被放大。在低等動(dòng)物中靶基因表達(dá)抑制效率大于９0％，甚至有人認(rèn)為每個(gè)細(xì)胞一份拷貝的dｓRＮA就可以封閉基因的效果。?③高成功率：RNAi已被用于線蟲全基因組的功能分析,其中有50％—80％序列選擇有效，12.9%—２7％的基因封閉產(chǎn)生了明顯的特別表型。?④種屬時(shí)—效性：Ｉｒｉｅ等人發(fā)現(xiàn)，在低等生物中RNAi可持續(xù)存在,但RＮＡi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中只能維持一段時(shí)間,一般注入dｓＲＮA后的2-3天，ＲNAi的作用最明顯，爾后1-2天內(nèi)，靶mRNＡ的豐度就能恢復(fù)到注射ＲＮAi之前的水平。這可能是由于RNA依靠的核苷脫氨酶脫氨基活性的逐步增高導(dǎo)致ｓｉＲＮA的生成削減而受到抑制。

⑤dsRNA的長(zhǎng)度限制性:引發(fā)有效RNAｉ的dsRNＡ最短不得短于2１nt，Dicｅr能與20０-5０0ｎｔ范圍內(nèi)的dｓRNA結(jié)合，底物片段越短,Ｄｉcｅr酶的活性也就越弱,提示RNＡｉ具有ｄsRNA片段長(zhǎng)度限制性。⑥ＲNAｉ的遺傳性:1998年Fｉre等就發(fā)現(xiàn)在線蟲中RNAi可以傳代,以后Worbｙ等人在果蠅的培育細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。線蟲中的ＲNＡｉ遺傳性需要Rｄe-１和Ｒｄｅ－２來啟動(dòng).?⑦傳播性：RNＡｉ效應(yīng)可以在細(xì)胞間集中，ｄｓRNA可在果蠅細(xì)胞群落之間傳播,在線蟲局部注射dsＲNA也可傳播到整個(gè)機(jī)體。Van等討論發(fā)現(xiàn)sｉｄ－1基因編碼一種具有十一次跨膜蛋白可能與此現(xiàn)象有關(guān)。

⑧ＡＴP依靠性:在去除ＡＴＰ的樣品中ＲNAi現(xiàn)象降低或消滅，顯示RNAｉ是一個(gè)ＡTP依靠的過程,可能與Dicer和RISC的酶切反應(yīng)必須由ＡTP供應(yīng)能量有關(guān).⑨模板選擇性：RＮAｉ只有效作用于外顯子,而對(duì)內(nèi)含子無影響.ｄsＲNA序列是某個(gè)基因的啟動(dòng)子序列時(shí)也沒有明顯的效應(yīng)。另外,RNAi對(duì)穩(wěn)定并豐富表達(dá)的靶基因抑制效率也不高。RＮＡｉ的生物學(xué)意義及其應(yīng)用ＲNＡｉ的生物學(xué)意義主要是維持基因組穩(wěn)定、抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)和保護(hù)基因組免受外源核酸侵入。討論證實(shí)RNＡｉ缺陷可引起內(nèi)源性轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)。轉(zhuǎn)座子緘默與DNA甲基化、H3mK9(hiｓｔｏnｅH3lｙｓｉne－9meｔｈｙｌation）和ＲＮAi有關(guān)，大多數(shù)轉(zhuǎn)座子緘默與ｍet1（ＤNAmetｈyltｒansfeｒａｓｅ)、ddm1(dｅcreaｓｅinＤＮAｍethｙlaｔion1）和ｓil１(Streptｏmyｃesｓｕbtｉliｓiniｎｈibitor—like１）有關(guān)，而很少的轉(zhuǎn)座子緘默需要KRYＰTOＮINＥ（H3Ｋ9mｅthyｌｔransｆerasｅ)、ＡＲＧOＮＡＵTＥ１(ＲNAｉｇenｅ)和CHROMOMEＴＨYＬASE３(ＣXGmｅtｈｙltrasfｅｒase）。Ｈaｌｌ等討論表明，著絲粒同源重復(fù)序列和RNAi組分一起正負(fù)調(diào)節(jié)著異染色質(zhì)的形成并且共同促使異染色質(zhì)組裝成核。最近討論發(fā)現(xiàn)，ＲNＡｉ需要的一種AＧＯ蛋白TｂAGO２與細(xì)胞有絲分裂和染色體分離有關(guān)。dｓＲNA還消滅在很多病毒(包括單鏈RNA病毒）感染的細(xì)胞內(nèi),誘發(fā)ＲNAi而封閉病毒生存和繁殖所必需的基因或激發(fā)干擾素誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng).RNAi還可能在胚胎發(fā)育過程中具有重要功能,也可能參加了生物體正常的基因表達(dá)調(diào)控，同時(shí)與基因印跡也有關(guān)。?RNＡi是一種高效的特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，近年來進(jìn)展飛快，很快就成為功能基因組討論的有力工具。通過實(shí)驗(yàn)手段將dｓRNＡ分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，特異性地降解細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的mRＮA,封閉內(nèi)源性基因表達(dá),從反向遺傳的角度討論人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)分離了果蠅胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通路中的各種成分。近來也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道通過ＲNAi討論細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前，曾利用反義RNA與靶mＲＮA序列互補(bǔ)的特性來抑制其表型的發(fā)生，但由于反義RNA對(duì)內(nèi)源性表達(dá)的基因抑制作用較弱，往往會(huì)產(chǎn)生一些過渡表型,易造成對(duì)基因功能推斷錯(cuò)誤,目前已通過審批認(rèn)為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物———Ｖitraｖenｅ.ＲNAｉ技術(shù)與之相比，特異性更高，作用更飛快,副反應(yīng)小,在有效地緘默靶基因的同時(shí),對(duì)細(xì)胞本身的調(diào)控系統(tǒng)也沒有影響。最近在人類體細(xì)胞里已經(jīng)成功地對(duì)近20種基因功能進(jìn)行了“敲除”，尤其是因此而了解了人類空泡蛋白Ｔsg1０1對(duì)HIV在人體內(nèi)增殖的作用，進(jìn)一步深化了對(duì)HＩV的討論。Leonｉd等以脊髓灰質(zhì)炎病毒為模型，利用RNAｉ來誘導(dǎo)細(xì)胞的胞內(nèi)免疫,產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)，尤其是針對(duì)ＲNA病毒。對(duì)于易突變的病毒,可設(shè)計(jì)多種靶向病毒基因保守序列的dsＲＮA，削減它對(duì)dsＲＮA的抵抗。Mａｅn等也應(yīng)用RＮＡi技術(shù)成功地阻斷了MCＦ-7乳腺癌細(xì)胞中一種特別表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Ｓp21的功能.RＮAi技術(shù)的應(yīng)用，不僅能大大推動(dòng)人類后基因組計(jì)劃（蛋白組學(xué))的進(jìn)展,還有可能設(shè)計(jì)出RNAｉ芯片，高通量地篩選藥物靶基因,逐條檢測(cè)人類基因組的表達(dá)抑制情況來明確基因的功能,并且它還將應(yīng)用于基因治療、新藥開發(fā)、生物醫(yī)學(xué)討論等領(lǐng)域,用ＲNＡi技術(shù)來抑制基因的特別表達(dá)，為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟了新的途徑。?簡(jiǎn)略可用于以下幾個(gè)方面：?１基因功能分析?基因敲除技術(shù)需要較長(zhǎng)時(shí)間去永久性的關(guān)閉某個(gè)基因的表達(dá)，而RＮAi技術(shù)則可在一周內(nèi)、甚至2天內(nèi)可控性的關(guān)閉10個(gè)基因.RNAi技術(shù)還具有一個(gè)優(yōu)勢(shì),能同時(shí)封閉多個(gè)基因或基因家族，用于討論ｍＲＮＡ差別剪接形成的異構(gòu)體,甚至在基因組水平上構(gòu)建針對(duì)基因組的RＮAi表達(dá)載體,用于討論基因之間的相互作用和進(jìn)行基因功能的高通量篩查.使用RNＡi技術(shù)在那些低等生物中基因組功能測(cè)定都已基本結(jié)束.在哺乳動(dòng)物和人類基因的功能討論中,Ｈaｒbｏrｔh等利用脂質(zhì)體及質(zhì)粒分別將編碼核纖層蛋白β1或β2、NＵP1５3、GAＳ41、ＡRC2１、胞質(zhì)動(dòng)力蛋白、蛋白激酶cdk１、β或γ肌動(dòng)蛋白以及非必須結(jié)構(gòu)基因ｅmerin和zｙｘin的siRNＡ轉(zhuǎn)染到Helａ、ＳＳ6細(xì)胞和大鼠F５、FR成纖維細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述基因的功能表現(xiàn)與以往使用基因剔除法獲得的信息全都。Sｕi等應(yīng)用DNＡ載體體外構(gòu)建目的基因的siRNA，包括外源綠色熒光蛋白、內(nèi)源Lamｉｎ－A、Lamin-Ｃ、cdｋ—2和dnｍt-１基因，轉(zhuǎn)染Hｅla、Ｈ１229、C－33Ａ、U-２OＳ細(xì)胞,結(jié)果顯示siRNA對(duì)目的基因的抑制作用均在86％以上。?2討論信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑?聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)，ＲNＡi技術(shù)可以很容易地確定簡(jiǎn)潔的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系,Cleｍeｎs等應(yīng)用ＲNAi討論了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑，取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全全都的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上分析了DSH３ＰＸ１(Docksrｃｈｏmolｏgy3phox１）與DAＣK（Drｏｓopｈilａactivａt(yī)edCdｃ42tｙrｏｓinｅkinasｅ)之間的關(guān)系，證實(shí)了DＡCK是位于DSH３PＸ1磷酸化的上游激酶。?3新藥物的討論和開發(fā)?RＮAi還可以作為尋找新的藥物靶標(biāo)的工具，可以高通量地發(fā)現(xiàn)藥物靶基因，幫助新藥物的討論和開發(fā)，了解藥物作用的生化模式等。Makiｍura等利用ＲＮＡi技術(shù)削減了丘腦下部ＡGRＰ（agｏuｔi—ｒeｌeｔedpeptiｄｅ）５0%的表達(dá)量，AGＲP使代謝率提高而不削減攝食量,從而減輕肥胖,為肥胖的治療供應(yīng)了一個(gè)靶點(diǎn)。美國(guó)Gｅｎeｔica公司已將ＲNAi技術(shù)作為高通量藥物靶標(biāo)識(shí)別和確認(rèn)的工具.?4基因治療?ＲNAｉ只抑制致病基因,而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，能削減非特異作用引起的副作用。?4。１治療病毒感染

可將ＲNAｉ視為一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制,利用ＲＮAi技術(shù)進(jìn)行病毒感染的干擾實(shí)驗(yàn)已在植物及低等生物中取得滿意的結(jié)果,但在人體細(xì)胞內(nèi)的實(shí)驗(yàn)才剛剛起步.已有討論表明,用siRNA抑制HIＶ的某些基因,如p24、ｖｉf、nef、tat或ｒev可阻礙ＨIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制;抑制ＨIV的受體CＤ４和ＣD8a或幫助受體CXＣＲ４或CCR5或病毒結(jié)構(gòu)Gag蛋白表達(dá)可阻礙HIＶ感染細(xì)胞.所以應(yīng)用sｉRNA可能成為防止HＩV—1感染的一種有效手段.Hamａsaki等構(gòu)建的siＲNA特異性表達(dá)載體與HBV病毒DNA共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞ＨuＨ7和HeｐＧ２,降低了RNA及其復(fù)制中間體的水平,并引起HBeＡｇ分泌的下降。最近,Soｎｇ等通過RＮAｉ技術(shù)使Faｓ基因緘默,成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中預(yù)防了肝衰竭和肝纖維化。?4．2治療腫瘤?腫瘤發(fā)生是多基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果,傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不行能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng),而RＮＡi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性,設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dｓRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)緘默的效應(yīng)，也可以同時(shí)注射多種dｓRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)緘默。Ｃiｏca等利用粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系討論了Ｒａf-1和ｂｃｌ-2基因在白血病中的作用，表明ＲＮAi能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療的敏感性。Zhａｎg等將針對(duì)鼠源VＥＧF（VａscｕlarＥndotｈｅｌiaｌGroｗthＦactor）各亞型基因的siRNA構(gòu)建成的ＲＮAi表達(dá)載體,均特異性抑制了各亞型ＶＥＧF的表達(dá),有效的抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。β—連環(huán)蛋白和APC基因是Wｎt信號(hào)通路中的重要組分,突變后引起細(xì)胞特別增殖，在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。Verma等利用RNAi技術(shù)使這兩個(gè)基因表達(dá)降低,在細(xì)胞和裸鼠中都能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。以ｅrbB1、端粒酶為靶點(diǎn)，利用RＮAｉ技術(shù)抑制腫瘤的討論也取得了滿意結(jié)果.?5其它應(yīng)用?ＲＮAi還可用于細(xì)胞周期調(diào)控、代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及DＮA損傷反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄或甲基化等多種方面的基因功能討論.最新討論發(fā)現(xiàn),用ＲNAｉ技術(shù)阻斷Nrｄｐ１（為ErbB3成員）、BRUCＥ（為一個(gè)5３0ｋDa的膜相關(guān)凋亡蛋白抑制因子）、Cｈｋ1、Ｗee1和Mｙｔ１等進(jìn)一步解釋了細(xì)胞凋亡的機(jī)制，其中BＲUＣE通常可抑制凋亡,而Nｒｄｐ1在凋亡初始階段起到格外重要的作用。RNAｉ相關(guān)術(shù)語(yǔ)１．ＲNAi：(RNＡiｎterfｅrencｅ）RNＡ干擾一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá),促使ｍRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為ＲＮA干擾(RNAｉntｅrｆeｒｅｎce，RNAｉ,也譯作RNA干預(yù)或者干涉)。它也是體內(nèi)抵擋外在感染的一種重要保護(hù)機(jī)制。２．sｉRNA：(smallｉnterｆeringRNＡs)小干擾ＲＮＡ一種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以同源互補(bǔ)序列的mＲNＡ為靶目標(biāo)降解特定的mRNＡ,這個(gè)過程就是RNA干擾途徑（RＮＡinｔerｆeｒenceｐａt(yī)hwaｙ).3.ｓｈRＮＡｓRNA—SｈｏrthａirpinRNＡｓ）短發(fā)夾RNA是設(shè)計(jì)為能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼?。襈A分子,短發(fā)夾RNＡ能夠通過RＮA干擾來抑制基因的表達(dá)。ThomaｓRoｓｅｎｑｕisｔ'sｇｒouｐ和ＧregＨannｏn'sｇrｏup聯(lián)合討論了在哺乳動(dòng)物種系細(xì)胞中shＲNAs的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致基因長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定緘默的機(jī)制。４。bpＢａsｅＰaｉr）堿基對(duì)兩個(gè)堿基（A和T，或者C和G)之間靠氫鍵結(jié)合在一起,形成一個(gè)堿基對(duì)。ＤNA的兩條鏈就是靠堿基對(duì)之間的氫鍵連接在一起，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。５。Basｅｓｅquence:堿基序列ＤNA分子中堿基的排列挨次。6.BasｅＳｅｑｕenceAnalysis:堿基序列分析分析出ＤＮA分子中堿基序列的方法(這種方法有時(shí)能夠全自動(dòng)化)?ｃＤNA：參見互補(bǔ)DNA。7.cＤNA:互補(bǔ)ＤNＡ以信使RNA為模板合成的DNＡ，常常采納互補(bǔ)ＤNA的一條鏈作為繪制物理圖譜時(shí)的探針.８。Compｌｅｍentaｒyｓeqｕence：互補(bǔ)序列以一條核苷酸鏈為模板，依據(jù)堿基互補(bǔ)規(guī)章形成的互補(bǔ)鏈，稱為該模板的互補(bǔ)序列。９.GeｎomｉcLiｂrarｙ:基因組文庫(kù)對(duì)某個(gè)染色體，制備隨機(jī)產(chǎn)生的、相互之間有重疊部分的片段的克隆。10．RIＳC：（RNA—inｄｕｃedｓｉｌenｃiｎｇcomplｅx)RＮA誘導(dǎo)緘默復(fù)合物在RNAi效應(yīng)階段,siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)緘默復(fù)合物。激活ＲＩSＣ需要一個(gè)ＡTP依靠的將siRNＡ解雙鏈的過程.激活的RISＣ通過堿基配對(duì)定位到同源mＲＮＡ轉(zhuǎn)錄本上,并在距離siＲＮＡ3'端1２個(gè)堿基的位置切割ｍRNA(3,1８,2７,２9）。盡管切割的精確機(jī)制現(xiàn)在還是未知，討論表明每個(gè)RIＳC都包含一個(gè)sｉRＮA和一個(gè)不同于Diｃｅr的RNA酶。１1．Diｃeｒ：Dicer酶ＲNaseIII家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員,能以一種AＴP依靠的方式逐步(pｒｏｃessiｖe）切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為１9—21ｂｐ的雙鏈ＲNＡs（sｉRNAs）,每個(gè)片斷的3’端都有２個(gè)堿基突出（27，28）。1２。PTＧS：(Post－transcriｐtｉonａｌGｅnｅＳiｌenｃｉng,PTGＳ）轉(zhuǎn)錄后基因緘默部分的植物中的基因緘默是在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生的。它是相對(duì)于部分植物中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄階段的基因緘默(TＧS)而言的。１3.TＧS:（ｔｒａnsｃｒｉptionａlｇeneｓiｌencing）轉(zhuǎn)錄階段基因緘默14.ｇｅnesｉlence：基因緘默討論結(jié)果發(fā)現(xiàn)有大量的轉(zhuǎn)基因植株不能正常表達(dá)，通常這并不是由于轉(zhuǎn)基因的缺失或突變引起的，而是基因失活的結(jié)果.這種失活的現(xiàn)象稱為基因緘默。1５.ＲNAtrａnsfectiｏn:RNＡ轉(zhuǎn)染。16。SenｓｅＲNＡ:正義鏈RＮA17．AntｉsenseＲNA:反義鏈RNA。１8.1922ntsiRNA:在細(xì)胞中雙鏈RNA一般都被切割成２1－23小片段，這樣的ＲＮA片段能達(dá)到更好的RNAi作用.人工合成的siRNA也是依據(jù)這個(gè)原理,所合成的ＲNA就是19nt的堿基序列再加上兩端的識(shí)別序列如－GＧ,-ＴT等.1９.SＥCｓｓｉRNAexｐrｅｓｓiｏncａsseｔｔeｓ）sｉRNA表達(dá)框架一種由PＣR得到的siＲNＡ表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。20.Homｏloｇiｅｓ：同源性指同種類不同個(gè)體或者不同種類個(gè)體之間的，染色體或者蛋白質(zhì)序列的相像性21。HｏmｏloｇoｕｓCｈromｏsomｅ:同源染色體一對(duì)染色體，分別來自父本和母本，染色體上有著相同的線性基因序列。22。ＲecombｉnａｎｔCloｎｅ:重組克隆?將不同來源的DNＡ片段合成在一個(gè)ＤNＡ分子中，這種技術(shù)稱為重組,得到的分子為重組克隆。２3.Riｂonucleｉcａｃiｄ：核糖核酸RNA從細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分分離出來的化學(xué)物質(zhì)。在蛋白質(zhì)合成和其他生化反應(yīng)中起著重要作用，RNA的結(jié)構(gòu)和DNA的結(jié)構(gòu)類似，都是有核苷酸依據(jù)肯定挨次排列成的長(zhǎng)鏈。RＮＡ可以分為信使ＲＮA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RＮA以及其他類型的ＲＮＡ。2４.ｒＲNA：（RNARiｂonsｏｍalRＮA，核糖體)存在于核糖體中的RNＡ。25。Ｒibｏｎsoｍｅ:核糖體細(xì)胞質(zhì)中含有ｒRNＡ和相關(guān)蛋白質(zhì)的細(xì)胞器,是蛋白質(zhì)的合成場(chǎng)所.2６.Transfoｒｍation：轉(zhuǎn)化將外源DNＡ整合到某一細(xì)胞基因組中的過程。2７．Ｅｎｔreｚ：美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心所供應(yīng)的在線資源檢索器。該資源將ＧenBaｎｋ序列與其原始文獻(xiàn)出處鏈接在一起。28。ＮCBI：(ＮatiｏnａlＣｅｎtｅrｆoｒBioｔechnolｏgyＩnｆormatioｎ）美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館(ＮLＭ）和國(guó)家健康協(xié)會(huì)(NIH）下屬部門之一,１98８年設(shè)立.主要供應(yīng)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的信息學(xué)服務(wù)，如世界三大核酸數(shù)據(jù)庫(kù)之一的GｅnBank數(shù)據(jù)庫(kù)，PｕbMed醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)等。29。GｅｎBaｎk：NＩH的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)是全部公開的DNA序列的集合(NucleｉcAcidsResｅarch１9９８Jan1；26（１）：１—７）。截至1９98年1２月,GeｎＢanｋ大約收集了2,１６２，０００，00０個(gè)堿基、3，044,００0個(gè)序列。３0.ＲibｏｓoｍａｌＲNＡ：(核糖體ＲＮA,簡(jiǎn)寫為rＲNA）是一組存在于核糖體中的RNA分子。３１.UｎｉGene：美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心供應(yīng)的公用數(shù)據(jù)庫(kù),該數(shù)據(jù)庫(kù)將ＧeｎＢaｎk中屬于同一條基因的全部片斷拼接成完整的基因進(jìn)行收錄.３2．BLAST:（BａｓicLoｃalAliｇnmｅｎtSｅaｒchＴool）基本的基于局部對(duì)準(zhǔn)的搜尋工具一種快速查找與給定序列具有連續(xù)相同片斷的序列的技術(shù)。是一個(gè)序列比對(duì)Ａｌignｍｅnt應(yīng)用程序。它可以在線選擇服務(wù)器上的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比較包括DNA／DＮＡRNA/DＮA蛋白/蛋白序列比對(duì)序列比對(duì)的作用很多如同源核酸或蛋白序列的查找引物或探針特異性分析物種進(jìn)化樹的構(gòu)建等等目前多數(shù)網(wǎng)站和軟件均供應(yīng)免費(fèi)的BＬAST的本地或在線檢索比較聞名的供應(yīng)序列比對(duì)服務(wù)有NCBI的BLAＳT檢索如果需要簡(jiǎn)略了解這個(gè)程序可到ＨYPEＲLＩNK”ｈtｔｐ：//wwｗ。nｃbi.nlm．ｎｉh.ｇｏv/ＢLＡＳT／＂http：/／wｗw.ncｂｉ。ｎlｍ.nih。ｇov／BLＡＳT／去簡(jiǎn)略看一看幫助文件但是上NＣBＩ需要國(guó)際代理國(guó)內(nèi)的伴侶可通過上海生科院的生物信息中心進(jìn)行BLAＳT網(wǎng)址ＨＹPＥＲLINK"ｈｔtp://ｂioinｆo。biosｉｎｏ．orｇ：88８8/ｂlａst/”hｔtp：/／bioｉｎｆo。ｂｉｏsｉｎｏ．org：8８８8/blast／速度不錯(cuò)3３．RＴ-ＰＣＲ：逆轉(zhuǎn)錄PCＲRT—PCR是以RNA為起始材料經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生cＤNA,再以cＤNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獵取目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。３4．DNＡ印跡雜交：（DNＡｂlｏｔhyｂｒｉｄizatｉon）有兩種核酸印跡法:?將DNA或ＲＮA溶液直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼農(nóng)膜上（斑點(diǎn)或狹線印跡)

?經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將片段的ＤＮA或RNA轉(zhuǎn)移到膜上(Sｏｕtｈern和Noｒtherｎ印跡法).DＮＡ在電泳前先用限制性內(nèi)切酶消化。35．RNA印跡雜交：（ＲNＡblotｈyｂriｄizａt(yī)ｉｏn)RＮA印跡雜交是一種檢測(cè)已固定在濾膜上的總RＮＡ或mRＮA特定靶序列的技術(shù).36.RNA酶掌握：在實(shí)驗(yàn)中前期的質(zhì)粒的構(gòu)建和提取是要用到RNAseA這種酶的存在會(huì)降解后期要轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)的ＲNA如果前期消滅了這個(gè)酶的污染就會(huì)導(dǎo)致后期實(shí)驗(yàn)的失敗,而后期轉(zhuǎn)錄是又要用到其他的RNA酶，如ＲNA聚合酶3等,因此在實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格掌握好ＲNA酶是RNA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,簡(jiǎn)略的做法是做到DＮＡ，RNＡ移液器的專用，DNA實(shí)驗(yàn)室和ＲNA實(shí)驗(yàn)室的物品和器械分開使用，將實(shí)驗(yàn)室中的任務(wù)污染源削減至最低.

RＮAi技術(shù)關(guān)鍵問題低等生物對(duì)ｄｓＲNA或siRＮＡ導(dǎo)入的條件要求較低,成功率較高，但對(duì)較高級(jí)的哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染成功率卻不抱負(fù).哺乳動(dòng)物的細(xì)胞對(duì)ｄｓRNA的導(dǎo)入具有抗拒性,并且值得注意的是大于30ｂｐ的dｓRNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞可誘導(dǎo)干擾素的合成結(jié)果是非特異性的和全面的抑制基因表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；同時(shí)ｄsRNA具有濃度依靠性，ｄsＲNA誘發(fā)的RNAｉ效應(yīng)的強(qiáng)度隨著其濃度的增高而增強(qiáng)，但是濃度過高RNAi效應(yīng)也會(huì)降低等。RNAi在哺乳動(dòng)物中的實(shí)驗(yàn)遇到的另一問題是RNAi衰減現(xiàn)象，siRＮA被導(dǎo)入細(xì)胞后RNAｉ效應(yīng)僅持續(xù)數(shù)天便逐漸消滅。此外RＮＡi技術(shù)和反義RNA技術(shù)一樣,有一些如寡聚核酸合成困難、易被降解、導(dǎo)入困難等相像的缺點(diǎn).?（1）ｄｓRＮA序列的選擇dsRNＡ主要選自已知的cＤNA的開放閱讀框架(ORF)中的基因區(qū)域。為防止mRＮＡ調(diào)控蛋白對(duì)RＩSＣ與靶RNA結(jié)合的干擾,應(yīng)避開選擇包括:1）起始密碼子下游或終止密碼的50~100核苷酸位置以內(nèi)的區(qū)域；2)5′或3′端的非翻譯區(qū)域；３）內(nèi)含子區(qū)域。此外,序列選擇時(shí)也應(yīng)避開多聚鳥苷酸序列區(qū)（≥３個(gè)），由于這樣容易形成四聚體結(jié)構(gòu)，抑制ＲNAi作用.選擇與靶mRNＡ上序列互補(bǔ)的21~２3個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段,以AA開頭為佳,由于此法能簡(jiǎn)化dsＲＮA合成過程，降低成本，而且合成的dsRNA能更好地抵抗RNA酶的降解。另外，盡量使ｄsRNＡ序列中的GC含量接近5０％(４5%～55％最佳），高GC含量能明顯降低基因緘默的效應(yīng).選擇前可以搜尋BLＡSＴ數(shù)據(jù)庫(kù)，保證無其他與靶基因同源的基因存在，避開引起對(duì)其他相像基因的緘默作用。并不是全部的mRNA均對(duì)RＮＡi敏感。為確保靶基因表達(dá)的有效抑制,最好同時(shí)合成兩個(gè)或以上的針對(duì)同一基因的不同靶區(qū)域的dsRＮＡ;而且,標(biāo)記dsRNA正義鏈的3′端對(duì)RNＡi現(xiàn)象并沒有影響,現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)mRＮＡ的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNAi有任何顯著的影響。目前,RNAi技術(shù)主要以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為對(duì)象討論其基因的功能。但>３0bｐ的dsＲＮA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中會(huì)引起干擾素樣效應(yīng)，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。因而直接選用其下游的產(chǎn)物分子ｓiRNA來代替，達(dá)到基因討論的目的.?(2）dsRNA的導(dǎo)入方法不同的生物體可以選擇不同的方法。簡(jiǎn)潔生物,如單細(xì)胞生物等，可選用電穿孔的方法;較簡(jiǎn)潔生物可選用dsRNＡ微注射入生殖細(xì)胞或早期胚胎，線蟲也能采納腸道或假體腔注射的方法，與微注射相比,RNＡi效率上并無顯著差別。還有浸泡法、工程菌喂養(yǎng)法、磷酸鈣共沉淀法等.若使用的是化學(xué)法人工合成的siRNA（正義鏈和反義鏈),還要經(jīng)過退火過程，以雙鏈的形式導(dǎo)入靶細(xì)胞。有人提出了以質(zhì)?；虿《緸檩d體,通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染途徑,在細(xì)胞內(nèi)以DNA為模板,利用RＮＡ聚合酶Ⅲ，轉(zhuǎn)錄為sｉRNA（直接形成雙鏈或通過回文序列折疊后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)）,也能產(chǎn)生較明顯的ＲNＡi效應(yīng).最近,又有一種新的導(dǎo)入方法，就是借助高壓水槍的外力將構(gòu)建的質(zhì)粒直接自小鼠的尾靜脈注入體內(nèi),觀察RNAi在活體生物模型而不是培育細(xì)胞上的基因緘默效應(yīng),但觀察到的sｉRNA的半衰期較短，而且由于使用了高壓的外力，過程較簡(jiǎn)潔，限制了其在人類疾病治療方面的應(yīng)用。而Ｐａchｕk等則提出了肌注的方法，將針對(duì)IL—12的siRNＡ的質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，得到的ＲNAｉ效應(yīng)更持久。?（3）發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的ｓiRＮA實(shí)驗(yàn)證明,發(fā)夾樣siRNA能延長(zhǎng)在細(xì)胞內(nèi)的作用時(shí)間.此類結(jié)構(gòu)可由具有回文序列的核苷酸鏈形成.但通?；匚慕Y(jié)構(gòu)不易獲得,也可用頭碰頭的對(duì)稱序列來代替.轉(zhuǎn)錄發(fā)夾樣ｓiRＮA的模板必須與載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子緊密相連,而且盡可能有最短的多聚腺苷酸尾巴，這樣才能誘導(dǎo)高效的RNＡi效應(yīng)。Paｄdisoｎ等提出類似的結(jié)構(gòu)也可應(yīng)用于長(zhǎng)片段dsRNA（5０0bｐ左右),而不會(huì)引起ＲＮA非特異性的降解.這為檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中經(jīng)過長(zhǎng)期發(fā)育后的基因功能供應(yīng)了新的途徑.RNAｉ抑制病毒討論技術(shù)路線ＲＮAi最主要的作用是一小段（大約2１—2３ｂｐ）的雙鏈RNＡ分子（doubｌe-stｒａinｄｅｄRＮA,dsRＮＡ）它介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)序列特異性基因表達(dá)阻斷或封閉，也就是轉(zhuǎn)錄后基因緘默（posｔ-ｔranscｒiｐtｉoｎaｌgeｎesilｅnｃinｇ，PＴＧS）,從而起到掌握細(xì)胞的各種高級(jí)生命活動(dòng)。?１．RＮAｉ的作用水平?RNAｉ是在多重水平上發(fā)揮作用的。最先在華麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，dｓＲＮＡ所誘導(dǎo)的基因緘默在轉(zhuǎn)錄后水平，由于dsＲＮA導(dǎo)致了相應(yīng)ＲNA(mRNA)的降解,而基因啟動(dòng)子和內(nèi)含子序列作為基因緘默觸發(fā)物則無效.后來在植物中也發(fā)現(xiàn),ＲNAi引起的基因緘默也是在轉(zhuǎn)錄后水平.

除此轉(zhuǎn)錄后水平降解ｍRNA的機(jī)制外,RNAi還通過其他機(jī)制來影響基因表達(dá)。在植物中,ｄsRNA導(dǎo)致基因組中與緘默觸發(fā)物同源序列的甲基化;如果與緘默觸發(fā)物與啟動(dòng)子序列相同,則引起轉(zhuǎn)錄水平的基因緘默.而另外的討論還發(fā)現(xiàn),在華麗新小桿線蟲中，ＲＮAｉ裝置中,內(nèi)源性編碼的誘導(dǎo)劑，是在蛋白質(zhì)合成水平發(fā)揮作用的。?2．RNＡi的作用的基本過程

第一步：起始步

緘默觸發(fā)物被裂解，產(chǎn)生小干擾性ＲNA(smallｉnterfｅringRNＡs，siＲNAs）。討論表明，果蠅胚胎提取物就有將長(zhǎng)鏈dｓRNA底物裂解為長(zhǎng)度在約22bp小片段的活性。這些siRNＡs是雙鏈的，有磷酸化的5ˊ端。這一過程,可能與RnaseⅢ家族的功能有關(guān).該家族中有一類已被命名為Diｃeｒ酶，含2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、1個(gè)螺旋酶結(jié)構(gòu)域和1個(gè)PAZ基序.遺傳學(xué)討論表明,Dｉｃer酶結(jié)構(gòu)在多種生物體之間比較保守.

其次步：效應(yīng)步

siＲＮAs與多種亞單位形成復(fù)合物-ＲNＡ誘導(dǎo)的緘默復(fù)合物（ＲISC),然后以RIＳC的方式降解單鏈的靶ｍRNＡ。在RISC中，這種大小約22bｐ的ｓｉＲNＡs所起的作用，是以堿基配對(duì)的原則,識(shí)別與dsＲNＡ相同序列的靶mRNA，引導(dǎo)復(fù)合物中的RＮA降解酶RＮａse，確保對(duì)特定的序列的靶ｍＲNＡ進(jìn)行降解。?第三步：緘默效應(yīng)的放大和集中

在華麗新小桿線蟲中，RNAi能夠集中到整個(gè)蟲體，即使只有少量的觸發(fā)物dｓRNＡ；在植物中也發(fā)現(xiàn)了相像的情況，緘默效應(yīng)集中到整株植物，并可轉(zhuǎn)移到嫁接的幼芽。討論發(fā)現(xiàn)，西紅柿中ＲNA指導(dǎo)的RＮA聚合酶（RdＲＰ)與RNAi的集中有關(guān);而華麗新小桿線蟲和植物中ｄsＲＮA誘導(dǎo)的基因緘默所需要參加的蛋白質(zhì)，在序列上與西紅柿的這種RdRP很相像；在其他生物體中，起RdRP作用的分別可能是:擬南芥屬-ＳＤE１／SGＳ2,脈孢菌屬—QDE-１,胚系華麗新小桿線蟲—ＥＧＯ－1，華麗新小桿線蟲成蟲—RRＦ—１/RDＥ-9；而病毒誘導(dǎo)的基因緘默（VＩＧＳ)，則是螺旋酶。有學(xué)者認(rèn)為,緘默效應(yīng)的放大和集中,是RdRP激發(fā)了另外的dsＲＮＡ合成。RNＡi技術(shù)及其實(shí)驗(yàn)操作－RNAi技術(shù)關(guān)鍵問題

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi技術(shù)策略?一、靶ｓiRNＡ序列選擇靶siRNＡＡ序列選擇是ＲＮAi實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵.哺乳動(dòng)物細(xì)胞ＲNAｉ實(shí)驗(yàn)中,使用最廣泛且最有效的是2１bpsｉRＮＡ。sｉRNA由正義鏈和反義鏈組成，兩條鏈3’端均有２個(gè)堿基突出,一般為ＵU或ｄTｄＴ，其中正義鏈的前１9nt與靶基因序列相同.1。siRNA設(shè)計(jì)的原則?SiRNＡ雙鏈設(shè)計(jì)時(shí)，一般在靶ｍRＮA起始密碼下游10０—200ｂｐ至翻譯終止密碼上游d0—1０0bp的范圍內(nèi)搜尋AＡ序列，并記錄每個(gè)AA3’端相鄰1９個(gè)核苷酸作為候選si．RNA靶位點(diǎn)。其中AＡ（N1９）TＴ是最抱負(fù)的序列，若靶mＲＮA中無此序列,亦可選用NＡ(N21）或ＮAＲ（N１7）ＹＮN（R表示嘌呤,Ｙ表示嘧啶)，但在合成時(shí)，sｉＲNＡ的正義鏈３’端需用dＴ-ｄT代替。TuscRｌ等建議設(shè)計(jì)的siRＮA不要針對(duì)mRＮＡ的５’和3'端非編碼區(qū)，由于這些區(qū)域有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn),而UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP（ｓiRNＡproteｉｎcoｍplex，核酸內(nèi)切酶復(fù)合物）結(jié)合mRNA，從而影響ｓiRNA干擾的效果。最后還應(yīng)將候選siＲNA序列在GenＢaｎk進(jìn)行BＬＡST檢索，與非同源基因具有３個(gè)或３個(gè)以上堿基相異的序列方可選用。2。高效ｓiRNA的序列結(jié)構(gòu)特征?除了靶序列位點(diǎn)的選擇，sｉIRＮA序列本身結(jié)構(gòu)特征亦會(huì)影響到RNAi效率。ＲNAi實(shí)質(zhì)上可視為一個(gè)RNA與蛋白質(zhì)互作過程,包括siRＮA與ＲＩＳC結(jié)合、RIＳC的激活以及ＲＩSC與靶mRNA的結(jié)合和切割,這種互作效應(yīng)的存在,往往造成siRＮA鏈的選擇具有偏愛性。Ｒｅｙnolds等通過對(duì)２個(gè)基因的18０條siRNA序列分析,歸納出以下8個(gè)與?ｓiＲNA高效性相關(guān)的特征：Ｇ/C含量低（3０％—５2%），正義鏈３’端具較低穩(wěn)定性（有利于sｉRNA與RISC的結(jié)合和解鏈),無反向重復(fù)序列(有利于減小siRＮＡ的有效作用濃度，提高siＲNA干擾效率)，正義鏈堿基的偏愛性Ａ１9(正義鏈中第19位堿基為A，如下表示類同）；A3；Ｕ1０；無G／C（正義鏈中第19位堿基不為G或C)；無G13。依此規(guī)章,Reyｎolｄｓ等設(shè)計(jì)的3０條sｉRNA中有29條是有效的.Kuｍikｏ等亦認(rèn)為siRＮA反義鏈5'端為A/Ｕ(即有義鏈Ｕ／A)１９和最后7個(gè)堿基中有5個(gè)A／Ｕ，會(huì)有助于ＲNAｉ的高效發(fā)揮，且正義鏈Ｇ/Ｃ１和序列中無連續(xù)9nt以上的ＧＣ重復(fù)片段與基因緘默效率呈顯著相關(guān).有趣的是，該實(shí)驗(yàn)還表明這些規(guī)章同樣適用于DＮA介導(dǎo)的RNAi（DＮA—baｓedRNＡｉ.）實(shí)驗(yàn)。此外,Ａmarｚｇuｉouｉ等發(fā)現(xiàn)正義鏈５’與3'端的前3個(gè)堿基中A/U含量不對(duì)稱(3'端含量應(yīng)高一些)和A６對(duì)siRＮＡ的活性亦影響很大.依據(jù)上述結(jié)果,可以初步繪制出一個(gè)高效ｓiＲNA序列結(jié)構(gòu)的精細(xì)與簡(jiǎn)略示意圖?，F(xiàn)已知道sｉRＮA的反義鏈決定著靶位點(diǎn)識(shí)別，那么在不影響siＲNＡ作用功效的前提下,是否可以對(duì)其正義鏈堿基作適當(dāng)更改或修飾呢？Ａmarｚgｕｉｏui等討論siRNA不同部位對(duì)堿基突變和化學(xué)修飾的耐受性，認(rèn)為siRNＡ的５’端相對(duì)于３’端具有對(duì)突變的較高耐受性.有學(xué)者認(rèn)為正義鏈3'突出端的任何堿基修飾對(duì)siＲNＡ作用效果均無明顯影響.還有學(xué)者認(rèn)為與反義鏈互補(bǔ)的正義鏈３’端發(fā)生1—４個(gè)堿基的錯(cuò)配反而有助于增強(qiáng)ＲNAI的活性.二、sｉＲＮＡ制備方法目前為止較為常用的5種制備ｓｉRNAs的方法包括化學(xué)合成?體外轉(zhuǎn)錄?長(zhǎng)片斷ｄｓRNAs經(jīng)ＲNａseIIＩ類降解（e.g.Dicer，E。colｉ,RNａsｅＩIＩ）

sｉRNＡ表達(dá)載體或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)sｉRNAs?PCR制備的sｉRNＡ表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)三、sｉＲNA的轉(zhuǎn)染將sｉRNＡ、sｉRNＡ表達(dá)載體或SECs導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是誘導(dǎo)RＮAI發(fā)生的關(guān)鍵.有很多轉(zhuǎn)染試劑可供選用，最常用的是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑.某些情況下電穿孔法亦可用，但易導(dǎo)致較高的細(xì)胞毒性反應(yīng)。對(duì)于同一細(xì)胞系，使用不同的轉(zhuǎn)染試劑或方法，其效率往往會(huì)有所不同；而對(duì)于不同的細(xì)胞系,使用同一種轉(zhuǎn)染試劑或方法,效果亦會(huì)不同.因此在實(shí)驗(yàn)過程中,有必要嘗試多種試劑或方法來確定最優(yōu)條件。轉(zhuǎn)染效率可通過測(cè)定細(xì)胞的密度,轉(zhuǎn)染的時(shí)間和sｉRＮA與轉(zhuǎn)染試劑的比例來評(píng)價(jià).四、實(shí)驗(yàn)對(duì)比設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)比是衡量RＮＡi．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可信度的一個(gè)重要因素.設(shè)立陽(yáng)性對(duì)比目的是通過檢測(cè)不同濃度的sｉRNA轉(zhuǎn)染效率及其最終干擾效果，來確定合適的轉(zhuǎn)染條件和最低有效的SIRＮA濃度。有實(shí)驗(yàn)表明RＩＳC復(fù)合物具有飽和性,且過多ｓiＲNA會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性和死亡。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，持家基因（如GAPDＨ，c-cｍyc，β—ａｃｉoｎ等)是較好的陽(yáng)性對(duì)比，針對(duì)這些基因的高效ＳIRNA序列已有報(bào)道。陰性對(duì)比是用來檢測(cè)RＮAｉ的特異性。通常作為陰性對(duì)比的ｓｉRＮＡ與選中的siRＮＡ序列有相同堿基組成,但與靶mRＮA無明顯同源性。陰性對(duì)比的siRNＡ序列設(shè)計(jì)有2種方法,一是將特異性ｓｉRNA的序列打亂，即“零亂"ｓiRＮA（ｓcramｂledｓiRNA),再對(duì)其進(jìn)行BLＡST比對(duì)，防止與目的靶細(xì)胞中的其他基因有同源性；另一種是在特異性ｓiRNＡ中引入幾個(gè)錯(cuò)配堿基.若引入的是一個(gè)堿基錯(cuò)配，應(yīng)需考慮它與突變mRNA(即SＮP位點(diǎn))結(jié)合能力，最好在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)就避開SNP區(qū)。五、RＮＡｉ效果檢測(cè)ＲＮAi效果可從mＲNA和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平來進(jìn)行量化.在ｍRＮＡ水平上，ＮoｒtheｒnBlｏt和實(shí)時(shí)定量PCR是兩種常用方法。值得注意的是在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR時(shí),cＤNA合成要用oｌｉｇo（dT），而不是隨機(jī)引物，且預(yù)擴(kuò)增片段最好位于靶ｍRNA序列中siRNA位點(diǎn)的上游。蛋白質(zhì)水平可以通過WeｓｔｅrnBlｏｔ、熒光免疫檢驗(yàn)法、流式細(xì)胞分析術(shù)和表型分析來檢測(cè)。RＮAｉ一般在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)發(fā)生，其引發(fā)基因緘默的程度和持續(xù)時(shí)間依靠于靶蛋白質(zhì)的降解率（ｔuｒnｏｖｅrrateｏfｔheｐrotein)、ｓiＲNA在細(xì)胞內(nèi)的壽命以及其逐漸被稀釋的程度.ＲNAi實(shí)驗(yàn)方法(一）siRNA的設(shè)計(jì)?1。在設(shè)計(jì)ＲＮＡi實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選:?HYPＥＲLＩＮK"hｔtp：／/www．geｎｅsil．com/ｂuｓinｅss/pｒｏdｕｃtｓ/oｒdｅr2。htｍ”htｔp：//ｗwｗ。geｎesil．ｃom/business/prｏｄucts／ordeｒ2。ｈｔm?HＹPERLINK"ｈttp：／/wwｗ.ａmbｉoｎ.ｃoｍ/tｅchlib／mｉsｃ/ｓｉRＮA_findｅr。hｔmｌ＂ｈtｔp://ｗwｗ.ａｍbion．cｏｍ/ｔechlib/miｓｃ/ｓiRNＡ_ｆiｎdeｒ。ｈtｍl?HＹPＥRLINK＂hｔtｐ：//wｗｗ。ic。ｓunyｓ/Stu／shilin／rnaｉ.ｈtｍl＂httｐ：／／ｗww.ic。ｓuｎysb。edｕ/Ｓｔu／shilin/rｎａｉ.hｔml?HYＰEＲＬＩNK"ｈttp：／/desiｇn.ｄharmａｃon．com／rnadｅｓｉgn/deｆaｕlｔ。aspx?SIＤ=４５３587１0＂ｈtｔｐ://ｄeｓｉ/ｒｎadｅsign/defａｕｌt.aspx？SIＤ＝4５３５8710?2．ＲＮAi目標(biāo)序列的選取原則：?（1）從轉(zhuǎn)錄本（ｍＲＮA)的AUＧ起始密碼開頭，尋找“AA”二連序列,并登記其3’端的1９個(gè)堿基序列,作為潛在的ｓｉRNA靶位點(diǎn)。有討論結(jié)果顯示ＧC含量在4５％—5５％左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。?Ｔu(píng)scｈl等建議在設(shè)計(jì)siRNＡ?xí)r不要針對(duì)５’和3＇端的非編碼區(qū)（unｔranslatedreｇioｎｓ，ＵTRs），緣由是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域,而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mＲＮＡ從而影響ｓiRNA的效果。?(2）將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人,或者小鼠,大鼠等等)進(jìn)行比較,排解那些和其他編碼序列/EST同源的序列。?例如使用BLASＴ(HYＰERＬＩNＫ”httｐ：//wwｗ．ｎｃｂｉ．nｌm.nｉh．ｇoｖ/BLASＴ/"ｗww.ｎcbi．ｎｌｍ。nｉh.gｏv/ＢLASＴ/)

（3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的ｓiＲNA,以找到最有效的sｉＲNA序列。

3．陰性對(duì)比?一個(gè)完整的ｓiRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)比,作為陰性對(duì)比的ｓiRNA應(yīng)該和選中的sｉＲＮA序列有相同的組成，但是和mRＮA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的sｉRNA序列打亂,同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒有同源性.?4．目前已證實(shí)的sｉRＮA可以在下面的網(wǎng)頁(yè)找到：?HYＰERＬIＮＫ"http：//ｄｅｓigｎ.ｄhａｒmacon.ｃｏｍ/ｃａｔalｏg／categｏｒy．a(chǎn)spx?kｅy=４9＂hｔtp：//desiｇn．dharmacoｎ．cｏｍ／caｔaｌog/ｃaｔｅgory。ａsｐx？key=４9?HYPＥRLＩＮＫ”ｈｔｔp：//wｗｗ.ａmbｉoｎ。cｏｍ/ｔecｈliｂ/ｔb/ｔｂ_502．html＂http：／/www.ambｉon.coｍ/ｔeｃhlｉb／ｔｂ／ｔb＿502．html?ＨYPＥRLIＮK”htｔp：/／ｗeb．ｍiｔ。edu/ｍmｃｍanuｓ/www／sｉRNＡDB．htｍl"ｈtｔｐ：//ｗeb.mｉt．edｕ／mmcｍａnus/www/siＲＮＡDB。html?ＨYPERＬINＫ”http：/／python．ｐenｇuindｒｅamｓ．ｎet/Oｒdｅr_Enｔｒy/jｓp/BｒoｗseCａｔaｌｏg．ｊｓp?Categoｒｙ＝Pｕbｌisheｄ”ｈttp：／/pｙｔhon．ｐenｇuｉndｒeams.ｎｅt／Orｄer＿Entｒｙ/jsｐ/ＢｒowseCataｌｏg.ｊsｐ？Caｔegorｙ=Ｐuｂｌｉsｈeｄ?(二)siRＮA的制備

目前為止較為常用的方法有通過化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長(zhǎng)片斷dsＲＮAｓ經(jīng)RＮａsｅIＩＩ類降解(e。g.Diceｒ，Ｅ。coｌi,RNaｓeＩII）體外制備siRNA，以及通過siRＮA表達(dá)載體或者病毒載體，PＣR制備的siＲNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siＲNA。體外制備?1．化學(xué)合成?很多國(guó)外公司都可以依據(jù)用戶要求供應(yīng)高質(zhì)量的化學(xué)合成ｓｉRＮA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng),格外是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—４對(duì)siＲNＡs的成本就更高了,比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。?最適用于：已經(jīng)找到最有效的sｉＲNA的情況下，需要大量sｉRNＡ進(jìn)行討論

不適用于：篩選sｉRＮＡ等長(zhǎng)時(shí)間的討論,主要緣由是價(jià)格因素?2.體外轉(zhuǎn)錄?以DNAOｌｉgo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNＡs,成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低,而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到ｓiRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能供應(yīng)足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的ｓiRNAs,但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有肯定的限制.而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用討論人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的sｉＲＮAｓ毒性小，穩(wěn)定性好,效率高，只需要化學(xué)合成的ｓｉRNA量的1/1０就可以達(dá)到化學(xué)合成ｓiＲNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。?最適用于：篩選siRNAs，格外是需要制備多種siＲＮＡｓ，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。?不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siＲNＡ.長(zhǎng)期討論。?3．用RＮaseIII消化長(zhǎng)片斷雙鏈RＮＡ制備siRNA?其他制備sｉRNＡ的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRＮＡ。而用這種方法—-制備一份混合有各種sｉRNＡｓ“混合雞尾酒”就可以避開這個(gè)缺陷。選擇通常是２00-１0０0堿基的靶mRNA模版,用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dｓRNA，然后用ＲNａｓeＩＩI（ｏrDｉceｒ）在體外消化，得到一種ｓiRＮAs“混合雞尾酒"。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個(gè)sｉＲNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞,方法和單一的ｓｉRNＡ轉(zhuǎn)染一樣.由于ｓiRNA混合物中有很多不同的siＲＮAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

ｄsRＮＡ消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過檢測(cè)和篩選有效sｉRNA序列的步驟，為討論人員節(jié)省時(shí)間和金錢(注意:通常用RNＡseＩII通常比用Dｉcer要廉價(jià))。不過這種方法的缺點(diǎn)也很明顯,就是有可能引發(fā)非特異的基因緘默,格外是同源或者是親密相關(guān)的基因。現(xiàn)在多數(shù)的討論顯示這種情況通常不會(huì)造成影響。?最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地討論某個(gè)基因功能缺失的表型?不適用于:長(zhǎng)時(shí)間的討論項(xiàng)目,或者是需要一個(gè)特定的ｓiＲＮA進(jìn)行討論,格外是基因治療體內(nèi)表達(dá)?前面的３種方法主要都是體外制備siＲNＡｓ，并且需要專門的ＲＮＡ轉(zhuǎn)染試劑將sｉRNAｓ轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采納sｉRNＡ表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到sｉＲNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RＮA。?4.ｓiRＮA表達(dá)載體

多數(shù)的ｓｉRNＡ表達(dá)載體依靠三種RNＡ聚合酶IIＩ啟動(dòng)子（ｐolIＩＩ）中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNＡ（shｏrtｈａiｒpiｎRＮＡ，shＲNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動(dòng)子包括大家熟識(shí)的人源和鼠源的U６啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采納RNApoｌIＩＩ啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RＮＡ,而且它是通過添加一串（3到6個(gè)）Ｕ來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體,需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNＡ序列的DＮA單鏈,退火,克隆到相應(yīng)載體的ｐolIII啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。?sｉRＮA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期討論——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá),持續(xù)數(shù)星期甚至更久.

病毒載體也可用于siRＮＡ表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因緘默的討論，避開由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便，而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。?最適用于:已知一個(gè)有效的siRNA序列,需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因緘默.?不適用于：篩選siRＮA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）.?5.sｉRＮA表達(dá)框架

siRＮＡ表達(dá)框架(ｓiＲNAｅxpｒｅsｓｉｏncasseｔtes,SＥＣｓ）是一種由PＣR得到的ｓｉRNＡ表達(dá)模版，包括一個(gè)RＮＡpoｌIIＩ啟動(dòng)子,一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)ｓiRNA，一個(gè)ＲNＡpolＩIＩ終止位點(diǎn),能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。和sｉRNA表達(dá)載體不同的是,SＥCs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PＣR得到，不用一天的時(shí)間.因此，SECｓ成為篩選siRＮA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的討論體系中啟動(dòng)子和ｓiRNＡ的最適搭配.如果在PCＲ兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過SＥＣs篩選出的最有效的ｓiＲNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNＡ表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siＲＮA和長(zhǎng)效抑制的討論。?這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是①PCＲ產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(晶賽公司的Protoｃｏl可以解決這一問題）②不能進(jìn)行序列測(cè)定，ＰCR和DＮＡ合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不抱負(fù)。?最適用于:篩選siＲＮA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子?不適用于：長(zhǎng)期抑制討論.（如果克隆到載體后就可以了）?(三)siＲNA的轉(zhuǎn)染?將制備好的sｉRNA，siRＮA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種:?１.磷酸鈣共沉淀

將氯化鈣，RＮA(或ＤＮA）和磷酸緩沖液混合,沉淀形成包含DNA且微小的不溶的磷酸鈣顆粒.磷酸鈣－DNＡ復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須當(dāng)心校準(zhǔn),保證質(zhì)量,由于甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。?２.電穿孔法

電穿孔通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜臨時(shí)穿孔。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染格外重要，由于過高的場(chǎng)強(qiáng)和過長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不行逆地?fù)p害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般,成功的電穿孔過程都伴隨高水平（5０%或更高)的毒性.

3．DＥAE—葡聚糖和polｙbreｎe?帶正電的DEAＥ-葡聚糖或ｐoｌybrｅne多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面.通過使用ＤMＳＯ或甘油獲得的滲透休克將ＤNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。ＤＥAE－葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。?４．機(jī)械法?轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍(bioliｓｔiｃｐａrtｉcle).顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNＡ，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核?；驑屖褂酶邏海韎ｃｒoprojectｉｌe將大分子導(dǎo)入細(xì)胞.

5。陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑?在優(yōu)化條件下將陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí),其可以形成微小的（平均大小約１00－４０0nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DＮA—陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物.據(jù)稱,一個(gè)約５kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2—4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DＮＡ就會(huì)被導(dǎo)入培育的細(xì)胞?，F(xiàn)存對(duì)DNＡ轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體.?為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率,在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過程中，需要注意以下幾點(diǎn):

１.純化siＲＮA?在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)ｓiRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNＡ，推舉用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15—２０％丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸,蛋白和鹽離子。注意:化學(xué)合成的ＲNA通常需要跑膠電泳純化（即ＰAGE膠純化）。?２．避開ＲNA酶污染?微量的ＲNＡ酶將導(dǎo)致sｉRＮA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中ＲＮA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，全部徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染格外重要。

３。健康的細(xì)胞培育物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性?通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn),推舉用5０代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。?4。避開使用抗生素?Ambiｏn公司推舉從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后７2小時(shí)期間避開使用抗生素?？股貢?huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素.有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在ｓiRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無血清的條件.這種情況下，可同時(shí)用正常培育基和無血清培育基做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。

5。選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑?針對(duì)sｉＲNA制備方法以及靶細(xì)胞類型的不同,選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對(duì)ｓiＲＮA實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。

６。通過合適的陽(yáng)性對(duì)比優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測(cè)條件?對(duì)大多數(shù)細(xì)胞,看家基因是較好的陽(yáng)性對(duì)比。將不同濃度的陽(yáng)性對(duì)比的ｓiRＮA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞（同樣適合實(shí)驗(yàn)靶siRNＡ），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)對(duì)比蛋白或ｍRＮA相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的siRＮＡ將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。?7.通過標(biāo)記sｉRNA來優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?熒光標(biāo)記的ｓiRNA能用來分析sｉＲNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率.標(biāo)記的ｓｉＲNA還可用作siＲNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(協(xié)作標(biāo)記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了ｓiRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來。設(shè)計(jì)siＲNAs的方法關(guān)于設(shè)計(jì)sｉRNA以及siRNＡ設(shè)計(jì)對(duì)siＲNA功能的影響，至今還沒有牢靠的規(guī)律。雖然我們可以通過對(duì)mRＮＡ實(shí)驗(yàn)分析精準(zhǔn)的找到一段基因的全部sｉRNA最佳作用位置,但這個(gè)過程十分耗時(shí)且昂貴，不推舉常規(guī)實(shí)驗(yàn)使用.一種做法是每個(gè)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3—４對(duì)siRNAｓ,實(shí)驗(yàn)選擇較有效的sｉRＮA.?

?目前，siRNＡ設(shè)計(jì)大都依據(jù)Tuscｈｌ的實(shí)驗(yàn)，要點(diǎn)如下：?１.目標(biāo)基