答辯(鐵皮石斛多糖)

組培鐵皮石斛多糖的提取及其抗氧化性研究(1)姓名：董燕平學號：20210453012專業(yè)：食品科學與工程學校：西南林業(yè)大學1目錄組培鐵皮石斛多糖簡介及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀試驗目的和意義試驗方法和內(nèi)容試驗結果試驗結論結果討論致

謝21.組培鐵皮石斛多糖簡介及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1.1組培鐵皮石斛多糖簡介鐵皮石斛〔D.candidumWall.exLindl.〕是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，生于海拔達1600米的山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境，種子極小、無胚乳，在自然條件下，需與某些真菌共生才能萌發(fā),故很難生產(chǎn)足夠的實生苗用于栽培;而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率極低，加上人為的過度采挖和破壞生境，其資源已瀕臨滅絕，是被國家列為重點保護的藥用植物之一。鐵皮石斛多糖系從鐵皮石斛植株里提取出的多糖類物質(zhì)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，多糖是石斛屬植物的主要活性成分，在抗衰老、抗腫瘤、降低血糖等方面有很好的作用，在治療胃腸道疾病、白內(nèi)障、關節(jié)炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等疾病有很好的療效。3

1.2鐵皮石斛國內(nèi)外研究現(xiàn)狀隨著我國經(jīng)濟的快速開展，人們生活水平的不斷提高，人們對健康和精神生活的需求和品位也日益提高，越來越多的人們認識到要用本身健康的東西來健康自己，鐵皮石斛是一味成效顯著的珍稀藥材，具有增強免疫力、消除腫瘤、抑制癌癥、潤肺清咽等藥用價值和保健作用，在國際國內(nèi)應用十分廣泛。鐵皮石斛成品目前主要加工成以下三種：〔1〕鐵皮楓斗。通過改進傳統(tǒng)的做法，使之從外觀、質(zhì)量等更符合現(xiàn)代消費者的習慣?！?〕研磨成粉末，做成膠囊，以盒裝保健食品的方式銷售。這個過程并不涉及到藥品加工，而申請食品保健還是很容易的。中科院植物所都有這樣的技術，且很成熟，只要買批號后委托加工就可以做出成品。這個保健品服用后效果表現(xiàn)為：睡眠安穩(wěn)綿長，無夜夢。白天精神飽滿，無疲態(tài)。胃口變好，無便秘。情緒安定，不易急躁和動怒。4〔3〕購置已有技術，做成中成藥。小規(guī)模臨床試驗證明，在化療及治療心血管疾病方面，鐵皮石斛中成藥輔助療效十分顯著。以片劑口服方式，可局部替代擴張血管的西藥煙酸注射液。隨著功能開發(fā)和應用技術的不斷開展，需求量在不斷上升，目前是國內(nèi)近百種藥品和保健品的必需原料，全國涉及用到石斛類的制藥廠和保健品加工企業(yè)有100多家。鐵皮石斛主要的消費市場在我國的浙江和上海一帶，另外就是港澳和東南亞地區(qū)，北京、廣州、成都等地近幾年市場開展較快，從我國石斛聯(lián)盟發(fā)布的市場信息來看，鐵皮石斛的市場和銷售都在快速開展。從相關信息來看，目前世界中草藥市場銷售額為160億美元，而且每年正以20~30％的速度增長，而我國的中草藥產(chǎn)業(yè)占整個醫(yī)藥市場的40％左右，近五年來以年平均20％的高速度遞增，鐵皮石斛所占中草藥產(chǎn)業(yè)比例越來越高。53.試驗方法和內(nèi)容3.1組培鐵皮石斛多糖的提取3.1.1組培鐵皮石斛多糖提取工藝流程組培鐵皮石斛水回流提取濃縮脫脂脫蛋白脫色枯燥組培鐵皮石斛多糖8破碎90℃，1h，料水比1:2060℃，0.75Kpa1h氯仿，正丁醇活性炭60℃3.1.2操作要點(1)破碎：組培石斛苗要充分的研磨破碎，有利于多糖的溶解別離。(2)提取：破碎的石斛組織于90℃、料水比1:20的條件下回流提取1小時，重復三次，合并提取液。(3)脫脂：濃縮液中參加100mL石油醚水浴回流至沸騰，抽真空過濾。(4)脫蛋白：以50mL多糖濃縮液，15mL氯仿，5mL正丁醇為標準比例混合振蕩，不加熱，離心機離心至離液面交界處無白色混懸物，也就是蛋白質(zhì)介于提取液與試劑交界處即可，并分別提取。9(5)枯燥：脫色后的多糖液于烘箱中用60℃熱風枯燥至恒重，保存?zhèn)溆谩?.2組培鐵皮石斛多糖含量的測定試驗采用蒽酮硫酸法測定組培鐵皮石斛多糖含量。3.2.1葡萄糖標準曲線的繪制精密稱取經(jīng)105℃枯燥恒重的標準葡萄糖0.05g〔精確到0.0001g〕，用溫蒸餾水溶解，并定容至1000mL。此溶液質(zhì)量濃度為50μg·mL-1。分別取上述葡萄糖溶液0mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL到25mL具塞試管中，用蒸餾水補足到2mL；在冰水浴中參加4mL的2g/mL的蒽酮-硫酸溶液，搖勻，置于沸水中加熱煮沸5min，取出后用流動水冷卻至室溫，以零管為空白，于625nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，對應吸光值為縱坐標建立標準曲線，如以下圖所示。

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3.2.2組培鐵皮石斛多糖含量的測定分別取組培鐵皮石斛多糖儲藏液(50μg·mL-1)和組培鐵皮石斛苗儲藏液(50μg·mL-1)1.6mL到25mL具塞試管中，用蒸餾水補足到2mL；在冰水浴中參加4mL的2g/mL的蒽酮-硫酸溶液，搖勻，置于沸水中加熱煮沸5min，取出后用流動水冷卻至室溫，以葡萄糖樣品中零管為空白，于625nm處測定吸光度。由標準曲線求得對應的多糖濃度，以葡萄糖計。113.3FRAP法測定組培鐵皮石斛的總抗氧化能力3.3.1硫酸亞鐵標準曲線的繪制取不同體積5～140μL的1mmol/LFeSO4溶液，用蒸餾水補足至2mL，再參加配制好的FRAP工作液3mL，混勻后于37℃反響30min，在593nm下測定樣品液的吸光度值，確定復原力標準曲線。以吸光度〔Y〕對葡萄糖質(zhì)量濃度〔X〕回歸，得到回歸方程y=0.0516x-0.0041，所得葡萄糖標準曲線如以下圖1所示。123.3.2組培鐵皮石斛多糖總抗氧化能力的測定分別精密移取不同樣品質(zhì)量50～300μg的3種待測樣品參加到有刻度試管中，加蒸餾水至2mL，再參加FRAP工作液3mL，混勻后于37℃反響30min，取出后立即在593nm處測定吸光度。以不加樣品組為參照，測定樣品吸光度值，每個樣品平行測3次，取平均值。根據(jù)復原力標準曲線，計算相同吸光度值的FeSO4當量濃度，記為FRAP值。3.4組培鐵皮石斛多糖去除羥基自由基的能力根據(jù)Fenton反響的方法，建立·OH自由基產(chǎn)生體系模型。在刻度試管中參加5mL的蒸餾水,30μL的0.02mol/L的FeSO4,100μL0.01mol/L水楊酸,最后參加25μL0.02mol/LH2O2啟動反響,放置37℃水浴保溫反響30min,之后立即在510nm處測定吸光度，作為空白吸光度值。同上，在刻度試管中分別參加不同系列5～60μg的樣品后，再參加25μL0.02mol/LH2O2啟動反響，水浴恒溫30min,之后測定吸光度值作為加樣品后吸光度值。去除率=[(A1-A0)/A0]×100%①式中:A1為參加待測物后的吸光值;A0為空白對照的吸光值。

133.5組培鐵皮石斛多糖抑制超氧陰離子自由基的能力試驗中采用鄰苯三酚自氧化—分光光度法測定抑制超氧陰離子自由基的能力。參加樣品前：將pH8.2Tris-HCl緩沖液和50mmol.L-1鄰苯三酚在25℃的恒溫水浴鍋中保溫，取5mLpH8.2Tris-HCl緩沖液，加30μL50mmol/L鄰苯三酚，搖勻，在325nm下立即測定。以pH8.2的Tris-HCl緩沖液為空白，每隔0.5min測一次吸光值，計算出平均值A0。參加樣品后：取5mLpH8.2Tris-HCl緩沖液，加待測樣品5～60μg、30μL50mmol/L鄰苯三酚，搖勻，立即同上測定。以pH8.2Tris-HCl緩沖液為空白，每隔0.5min測一次吸光值，計算出平均值A1。抑制率=[(A0-A1)/A0]×100%②式中：A1為參加待測物后的吸光值;A0為空白對照的吸光值。143.6組培鐵皮石斛多糖去除DPPH自由基的能力3.6.1DPPH標準曲線的繪制精密稱取DPPH0.0202g，加甲醇溶解定容至50mL，作為儲藏液。精密移取上述儲藏液10mL至100mL容量瓶中，定容得40.4mg·L－1的儲藏液備用。分別精密移取DPPH儲藏液0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL于10mL刻度試管中，用甲醇定容至刻度，搖勻，以甲醇溶劑作參比，在515nm處測定各溶液的吸光度。以DPPH的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。配制DPPH標準溶液系列，繪制出DPPH標準曲線見圖6。標準曲線線性回歸方程為y=0.0208x+0.0009，在DPPH質(zhì)量濃度為2～16mg·L－1線性關系良好。153.6.2組培鐵皮石斛多糖去除DPPH自由基的能力分別在1.0mLDPPH儲藏液中參加不同質(zhì)量(200～800μg)樣品待測物，用甲醇稀釋至總體積為3.00mL，混勻放置40min后，用1cm比色皿于515nm處測定吸光度，根據(jù)DPPH標準曲線回歸方程計算DPPH質(zhì)量濃度，按以下公式計算DPPH去除率(Y)。Y=(1-Ct/C0)×100%③式中:C0為反響體系中DPPH的起始質(zhì)量濃度(mg·L－1);Ct為40min后反響體系中DPPH的質(zhì)量濃度(mg·L－1)。

164試驗結果4.1組培鐵皮石斛多糖提取結果：組培鐵皮石斛苗在搗碎情況下于90℃、料水比1:20、1小時條件下浸提，重復操作三次，最后得組培鐵皮石斛多糖得率為4.25％。

4.2多糖含量測定結果：將組培鐵皮石斛多糖和組培鐵皮石斛苗用蒽酮-硫酸法測定多糖含量，組培鐵皮石斛多糖和組培鐵皮石斛苗中多糖的純度分別是：73.15％，10.51％。由此可見，組培鐵皮石斛多糖中可被檢測到的多糖明顯超過組培鐵皮石斛苗。174.3FRAP法測定組培鐵皮石斛的總抗氧化能力結果：

由以下圖可知，當樣品參加量在50～300μg范圍時，隨著組培鐵皮石斛多糖、組培鐵皮石斛苗及維生素C參加量的增加，其總抗氧化的能力也隨之增強。組培鐵皮石斛苗的抗氧化能力最弱，組培石斛多糖抗氧化能力相對較強，而維生素C的總抗氧化能力優(yōu)于組培鐵皮石斛苗?？傮w說來組培鐵皮石斛多糖的總抗氧化能力明顯比組培鐵皮石斛苗強得多。184.4組培鐵皮石斛多糖去除羥基自由基的能力測定結果：依據(jù)Fenton反響體系建立的去除羥基自由基能力，其結果如以下圖所示。由圖可知，組培鐵皮石斛多糖對羥基自由基去除能力高于其余樣品，維生素C對羥基自由基去除能力相對較低，而組培鐵皮石斛苗對羥基自由基去除能力最低。由此可知，組培鐵皮石斛多糖對羥基自由基去除能力較高，而組培鐵皮石斛苗對羥基自由基去除能力相對較弱。194.5組培鐵皮石斛多糖抑制超氧陰離子自由基的能力測定結果：不同樣品抑制超氧陰離子能力如圖所示。由圖可知，三種不同物質(zhì)都具有一定的抑制超氧陰離子自由基的能力。隨著樣品含量的增加，樣品抑制超氧陰離子自由基的能力不斷增強。組培鐵皮石斛苗抑制超氧陰離子自由基的能力相對較弱，當樣品加量為10μg時，對超氧陰離子自由基的抑制率僅為3.48%，加樣量增大到60μg時，抑制率也僅為23.47%；組培鐵皮石斛多糖抑制超氧陰離子自由基能力相對較強，即當樣品質(zhì)量均增加到60μg時，組培鐵皮石斛多糖抑制超氧陰離子自由基能力到達了47.08%，維生素C次之，抑制超氧陰離子自由基能力到達了44.19%。204.6組培鐵皮石斛多糖去除DPPH自由基能力測定結果：根據(jù)標準曲線，得出三個樣品去除DPPH自由基能力如下圖。

由圖可知，隨著反響體系中參加組培鐵皮石斛多糖、組培鐵皮石斛苗及維生素C的質(zhì)量愈大，其去除DPPH自由基的能力愈強。對不同樣品物質(zhì)所表現(xiàn)出來的去除DPPH自由基的能力有所不同。實驗結果說明，組培鐵皮石斛多糖去除DPPH自由基的能力相對較強，當石斛多糖質(zhì)量為700ug時，組培鐵皮石斛多糖去除率到達51.91%，而其他兩個樣品對DPPH的去除率效果均低于組培鐵皮石斛多糖。215.結論與討論

5.1結論：(1)通過研究說明，將組培鐵皮石斛多糖和組培鐵皮石斛苗用蒽酮-硫酸法測定多糖含量，石斛多糖和石斛含糖量分別是：73.15％，10.51％，組培鐵皮石斛多糖中可被檢測到的多糖含量明顯超過了等質(zhì)量的組培鐵皮石斛苗；由此可見，我們將組培鐵皮石斛中的多糖進行提取純化，進而應用于食品加工中，具有重要意義。(2)三種不同樣品的濃度愈大，去除羥基自由基的作用愈強，其中組培鐵皮石斛多糖對羥基自由基去除能力較高，當參加樣品質(zhì)量到達60μg時，去除率到達91.40%，而維生素C去除能力相對較弱，組培鐵皮石斛苗對羥基自由基去除能力相對最差。(3)隨著樣品質(zhì)量的增加，抑制超氧陰離子自由基的能力增強，組培鐵皮石斛多糖當其質(zhì)量到達10μg以上時，抑制率到達22.12%以上，組培鐵皮石斛苗抑制超氧陰離子自由基的能力也相對較弱，當其質(zhì)量到達10μg時，其對超氧陰離子自由基抑制率僅為3.48%，維生素C抑制超氧陰離子自由基的能力相對好些，到達6.08%。22(4)采用DPPH法對組培鐵皮石斛苗、組培鐵皮石斛多糖及維生素C進行了抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)組培鐵皮石斛苗、組培鐵皮石斛多糖及維生素C在低濃度和高濃度時，均有一定的去除DPPH自由基的能力，當質(zhì)量增大到400μg時組培鐵皮石斛苗去除率高過維生素C，當質(zhì)量增大到700μg時維生素C去除率高過組培鐵皮石斛苗達45.27％；鐵皮石斛多糖去除DPPH自由基的能力一直高于另外兩個樣品，當質(zhì)量增大到700μg時去除率到達51.91%。5.2討論：(1)在組培鐵皮石斛多糖的提取過程中，恒溫萃取和真空濃縮都涉及到溫度的控制，在實驗過程中應嚴格控制溫度。通過查閱資料得知鐵皮石斛多糖不耐高溫，高溫會使多糖氧化分解，從而影響試驗數(shù)據(jù)結果，所以在多糖提取過程中對溫度的控制要格外認真、仔細。(2)制作硫酸亞鐵標準曲線和樣品總復原能力測定時使用到FRAP工作液，該工作液要現(xiàn)用現(xiàn)配，否那么會產(chǎn)生絮狀物，從而影響試驗效果或數(shù)據(jù)。23(3)在測定三個樣品抑制超氧陰離子時要準確把握試驗過程中試劑參加的時間，保證是同一個人操作這個過程，減小因為個人操作不同帶來時間把握上的差異。因為此實驗過程中要求配好溶液立即測定，每個樣品測定三次吸光值，且每隔30秒測一次。因此，在操作時不能等所有樣品加好后統(tǒng)一測定，這樣得出的試驗數(shù)據(jù)就沒有任何意義。

(4)通過測定三種不同樣品去除自由基能力的結果說明：不同樣品物質(zhì)在去除自由基時，局部低濃度去除自由基能力相對較低的樣品物質(zhì)，隨著濃度的依次增大，