天然藥物化學(xué)第三節(jié)

(一)根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離

1.原理:相似者相溶2.方法:1)結(jié)晶及重結(jié)晶法溫度不同，溶解度不同2)混合溶劑法:改變?nèi)芤旱臉O性去雜(H2O--EtOH、EtOH--H2O、EtOH--Et2O)三、中草藥有效成分的分離與精制樣品

少量易溶樣品溶劑樣品溶液

滴加難溶樣品溶劑放置沉淀

粗組份

3)酸堿法4)沉淀法酸水液無機(jī)酸鹽H2OH2S有機(jī)酸鹽重金屬硫化物有機(jī)酸有機(jī)溶劑萃取有機(jī)溶劑萃取生物堿酸提堿沉法：生物堿堿提酸沉法：黃酮、蒽醌類酚酸性成分酸性成分形成鉛鹽、鈣鹽、鋇鹽沉淀；堿性成分形成苦味酸鹽、苦酮酸鹽、雷氏鹽沉淀。

1.原理:利用物質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)的不同達(dá)到分離2)分離因子（β值）與分離難易的關(guān)系K=CU/CLb=KA/KBK值與萃取次數(shù)成反比，即K值越大，萃取次數(shù)越少，反之越多1)分配系數(shù)（K值）與萃取次數(shù)的關(guān)系（二）根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)

行分離（KA>KB）β

≥100一次萃取可基本分離10≤β

<10010-12次萃取可基本分離β

≤2100次以上萃取可基本分離液－液萃取條件（可通過紙色譜確定）

紙色譜是一種分配色譜(相當(dāng)于多次萃?。?，可借助紙色譜求β值，并選擇理想的分離條件。K=CO/Cw=1/r[Rf/(1-Rf)]r:紙色譜定數(shù)(當(dāng)紙色譜濕重為干重的1.5倍時(shí)r=2)CO:在有機(jī)相中的濃度Cw:在水相中的濃度

β=KA/KB=1/r[Rfa/(1-Rfa)]1/r[Rfb/(1-Rfb)]Rfa(1-Rfb)Rfb(1-Rfa)=將紙色譜的Rf值代入即可求出β，進(jìn)行多次紙色譜就可找出最佳分離條件B.Ka

與

pKa

表示酸堿性化合物酸堿性強(qiáng)弱,而pH值變化則可改變化合的存在狀態(tài)。3)酸堿度（pH值）對分配比的影響A.游離型與解離型物質(zhì)因素KapKapH<3pH>12親脂溶劑親水溶劑酸性物質(zhì)越大越小游離型解離型游離型化合物分配比大解離型化合物分配比大堿性物質(zhì)越小越大解離型游離型逆流分溶法(CCD)特點(diǎn)：

①條件溫和，試樣易回收。②溶質(zhì)濃度越低，分離效果越好。③試樣極性過大過小、分配系數(shù)受溫度濃度影響過大、易乳化不宜采用。適用：中等極性、不穩(wěn)定成分分離。液滴逆流色譜(DCCC)、高速逆流色譜(HSCCC)特點(diǎn)：分離條件溫和，無死吸附，樣品易回收，不易乳化，分離效果較好。適用：極性大的成分如皂苷、糖類等。液-液分配柱色譜：支持劑：硅膠(含水可達(dá)17%)

、硅藻土、纖維素粉等。（1）正相分配色譜：固定相：水、緩沖溶液流動(dòng)相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱極性有機(jī)溶劑洗脫順序：極性小先出柱。應(yīng)用：分離水溶性或極性較大的成分。（2）反相分配色譜：固定相：化學(xué)鍵合固定相親脂性：Rp-18>Rp-8>Rp-2流動(dòng)相：水或甲醇等強(qiáng)極性有機(jī)溶劑常用：甲醇-水，乙腈-水（三）根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離固-液吸附物理吸附化學(xué)吸附半化學(xué)吸附1.吸附層析的種類

2.物理吸附

1）基本規(guī)律：“相似者易于吸附”。2）基本特點(diǎn)：無選擇性、可逆吸附、快速。3）基本原理：吸附與解吸附的往復(fù)循環(huán)。4）三要素—吸附劑、溶質(zhì)(被分離物)、溶劑。常用吸附劑：硅膠、氧化鋁、活性碳。硅膠：使用面寬，對堿性弱的生物堿也可使用。

氧化鋁：有酸性、中性、堿性之分。具有載樣量大，吸附力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，多用于生物堿的分離。極性吸附劑非極性吸附劑活性碳①吸附力與吸附劑，洗脫劑，分離物質(zhì)的關(guān)系：a、極性吸附劑對極性大的溶質(zhì)易吸附；極性大溶劑洗脫能力強(qiáng)；b、非極性吸附劑對極性小的溶質(zhì)易吸附；極性大溶劑洗脫能力弱；c、溶質(zhì)即使被硅膠和氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強(qiáng)的溶劑時(shí)，又可被后者置換洗脫下來。

吸附劑含水量吸附力洗脫易Rf值洗脫劑極性洗脫力洗脫易Rf值分離物極性吸附力洗脫難Rf值②溶劑的極性—依據(jù)介電常數(shù)來決定。環(huán)己烷石油醚苯乙醚氯仿乙酸乙酯1.881.892.294.475.206.11正丁醇丙酮乙醇甲醇水17.820.726.031.281.0③分離物質(zhì)極性順序：

COOH>ArOH>ROH>RNH2,RNHR’,RNR’R”>RCONR’R”>RCHO>RCOR’>RCOOR’>ROR’>RH

>極性極性強(qiáng)弱的判斷：與功能基的種類、數(shù)目多少和排列方式有關(guān)。a、游離型化合物極性弱、具親脂性，解離型化合物極性強(qiáng)，具親水性。b、對于骨架相同的化合物，根據(jù)所含取代基的極性判斷分子的極性強(qiáng)弱。親水性基團(tuán)與極性成正比，親脂性基團(tuán)與極性成反比；c、骨架相同，取代基數(shù)目和種類不同，如果數(shù)目相差不大，含有極性最大官能團(tuán)的化合物的極性最強(qiáng)。>d、骨架不同，取代基數(shù)目相差較大時(shí)，要具體情況具體分析。CHOCH2OHOHOHOHHOCH3(CH2)14COOH>極性1235746活性碳常用于黃酮苷的純化、雜質(zhì)的除去(脫色)、污水處理以及從水中富集化學(xué)成分等。吸附力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系：分子量大>分子量小芳香族>脂肪族

吸附力與洗脫劑的關(guān)系(洗脫能力)：吡啶>15%酚/醇>7%酚/水>醇>含水醇>水

甲醇提取液活性碳

攪拌,靜置,上清液無黃酮反應(yīng)為止活性碳7%酚／水15%酚／醇洗脫液乙醚乙醚(殘余酚)黃酮苷(用吡啶可將苷元洗脫下來)第一章總論色譜柱應(yīng)用注意事項(xiàng)

①裝柱前

吸附劑的選用和用量：酸性成分，堿性成分吸附劑的粒度：常壓、加壓色譜柱的選用②裝柱時(shí)

盡量少的極性小的裝柱溶劑溶解試樣和裝柱如在裝柱溶劑中不易溶解，可用少量極性大的溶劑溶解拌樣裝柱一次成功，柱子均勻結(jié)實(shí)③洗脫時(shí)

洗脫溶劑多用混合溶劑，極性逐漸增大，跳躍不能太大；分離酸堿性物質(zhì)時(shí)防止拖尾；洗脫條件選擇TLC3.化學(xué)吸附1）基本特點(diǎn)：有選擇性、不可逆吸附。2）基本原理：產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。

①酸性物質(zhì)與Al2O3發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；②堿性物質(zhì)與硅膠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；

③Al2O3容易發(fā)生結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化。3）應(yīng)盡量避免。4.半化學(xué)吸附1）基本特點(diǎn)：介于物理吸附和化學(xué)吸附之間；2）基本原理：以氫鍵的形式產(chǎn)生吸附；3）吸附劑：聚酰胺。3聚酰胺吸附色譜法聚酰胺的性質(zhì)及吸附原理：聚酰胺是高分子聚合物，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚等常用溶劑，對堿較穩(wěn)定。對酸尤其是無機(jī)酸穩(wěn)定性較差，可溶于濃鹽酸、冰醋酸及甲酸。一般屬于氫鍵吸附。適合分離酚類、醌類、黃酮類。結(jié)構(gòu)與吸附力的關(guān)系

a、形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，吸附能力越強(qiáng)；b、易形成分子內(nèi)氫鍵者，吸附力降低；>>>>>c、芳香化程度高，吸附力強(qiáng)；d、苷元相同；苷元>單糖苷>雙糖苷>三糖苷>(3)洗脫劑的洗脫能力尿素/水>二甲基甲酰胺>甲酰胺>堿水溶液>丙酮>甲(乙)醇>水常用的溶劑:水乙醇一般不用含氯的溶劑(可溶解聚酰胺或其中的交聯(lián)劑)。(4)應(yīng)用一般酚類、黃酮類吸附可逆鞣質(zhì)不可逆尚用于生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸大孔吸附樹脂

（1）性質(zhì)和吸附原理：性質(zhì)：不溶于酸堿及有機(jī)溶劑中，對有機(jī)物選擇性大，不受無機(jī)鹽和低分子化合物的影響。機(jī)理：氫健、分子篩。（2）影響吸附的因素：①樹脂的因素：極性、比表面積、孔徑。②溶劑的性質(zhì)③化合物的性質(zhì)、分子量、極性、形成氫鍵的能力。（3）應(yīng)用：主要用于活性部位的富集，有效部位或單體化合物的分離，極性化合物的分離等。（四）根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離1.凝膠過濾法：

－凝膠滲透、分子篩濾過、排阻色譜（1）原理：分子篩原理

凝膠是在水中不溶，但可膨脹的球形顆粒并具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，利用分子篩的過濾作用將化合物按分子量大小不同進(jìn)行分離。適用于糖苷類成分的分離。（2）出柱順序：分子量由大到小。（3）常用的載體:葡聚糖凝膠（SephadexG-25）是由葡聚糖和甘油基通過醚橋相交鏈而成的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，只適用于在水中應(yīng)用。

羥丙基葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)不但可在水中用，也可在有機(jī)溶劑中用或在水與有機(jī)溶劑的混合溶劑中使用。-OH-OCH2CH2CH2OH羥丙基化（五）根據(jù)物質(zhì)解離程度不同進(jìn)行分離原理：離子交換原理利用酸、堿化合物在解離狀態(tài)時(shí)與陰、陽離子樹脂產(chǎn)生離子交換的原理達(dá)到分離的方法。適于分離酸、堿類化合物。固定相：離子交換樹脂流動(dòng)相：水或含水溶劑（五）根據(jù)物質(zhì)解離程度不同進(jìn)行分離R-SO3-H++BH+RSO3BH+RSO3-H++BOH-R-N+(CH3)3Cl-+R’COO-R-N+(CH3)3-OOCRR-N+(CH3)3Cl+R’COOHHCl根據(jù)離子交換基團(tuán)不同分為：①陽離子交換樹脂

強(qiáng)酸性（-SO3－H+）弱酸性（-COO－H+）②陰離子交換樹脂

強(qiáng)堿性[-N+（CH3）3Cl－]弱堿性（-NH2，-NHR,-NRR

）離子交換法的應(yīng)用①用于不同電荷離子的分離強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂樣品流出液（酸性及中性化合物）流出液（中性化合物）流出液（堿性化合物）洗脫液（酸性化合物）洗脫液（兩性化合物）氨水洗脫液堿性及兩性化合物稀ZaOH洗脫稀HCl洗脫②用于相同電荷離子的分離如：有三種生物堿，堿性強(qiáng)弱為A﹥B﹥C，將三者混合物的水溶液通過弱酸性樹脂，隨后用水洗，則流出先后順序?yàn)椋篊BA分配層析小結(jié)分配層析吸附層析排阻層析離子交換層析

原

理分配系數(shù)差異極性差異分子大小差異解離度差異要素溶

質(zhì)溶解度極性分子量酸堿性溶

劑固定相/流動(dòng)相(互不相溶的液體;恒定不變)依溶質(zhì)和吸附劑極性而變;可變,由小到大恒定(洗脫劑)恒定(氨基酸pH可變)(流動(dòng)/交換)載

體√√吸附劑√(活性)*化學(xué)吸附固定相√(陰、陽樹脂)相關(guān)因素K值、b因子pH值極性（活性）氫鍵（聚酰胺）交聯(lián)度（分子大小）交聯(lián)度（交換當(dāng)量）應(yīng)

用CC、TLC、PC、HPLCCC、TLCHPLCCCCC第五節(jié)結(jié)構(gòu)研究法一、化學(xué)結(jié)構(gòu)研究的目的與意義二、結(jié)構(gòu)研究的程序與方法三、中藥有效成分的波譜測定意義：為探討有效成分的生物活性、構(gòu)效關(guān)系、體內(nèi)代謝以及進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、人工合成等研究提供必要的依據(jù)。前提：必須是單體化學(xué)成分，這是鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)的前提。單體化合物的生物活性、人工合成或結(jié)構(gòu)修飾等工作，均是建立在單體化合物結(jié)構(gòu)明了的前提下。一、化學(xué)結(jié)構(gòu)研究的目的與意義(一)查閱文獻(xiàn)(二)化合物純度的測定1.外觀：晶型與色澤2.Mp3.TLC(三)物理常數(shù)測定包括熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、比旋度、折光率和比重等的測定。

(四)分子式的確定1.元素分析法2.質(zhì)譜法—HR-MS3.同位素豐度法(五)不飽度的計(jì)算了解可能含有的雙鍵數(shù)或環(huán)數(shù)

(六)分子結(jié)構(gòu)骨架的測定主要依靠各類中藥化學(xué)成分的呈色反應(yīng)(七)功能團(tuán)的判斷1.化學(xué)法2.光譜法二、結(jié)構(gòu)研究的程序與方法（一）紅外光譜（IR）分子價(jià)鍵因紅外光照射產(chǎn)生伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)而產(chǎn)生紅外吸收特征頻率區(qū)：4000~1500cm-1（特征官能團(tuán)）指紋區(qū)：1500~600cm-1官能團(tuán)判斷（羥基、氨基、羰基、芳環(huán)）三、中藥有效成分的波譜測定各基團(tuán)的紅外光譜3300~3000弱吸收：烯氫、芳?xì)洹=N

強(qiáng)吸收：O-H、N-H3000~2700飽和C-H2400~2100不飽和三鍵1900~1650C=O及其衍生物1680~1500C=C及芳香核骨架震動(dòng)、C=N等1500~1300飽和C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)1000~650不飽和C-H面外彎曲振動(dòng)（二）紫外－可見吸收光譜（UV）電子躍遷（激態(tài)到激發(fā)態(tài)）而產(chǎn)生的電子能級譜解決不飽和共軛體系化合物的問題光譜范圍：波長4~800nm，近紫外（200nm~400nm）遠(yuǎn)紫外（4~200nm），可見（400nm~800nm）應(yīng)用:共軛雙健、α,β不飽和羰基化合物、芳香族化合物。（三）質(zhì)譜法確定分子式、分子量、碎片離子峰EI-MSFD-MSFAB-MS目前主要利用高分辨質(zhì)譜（HI-MS），特點(diǎn)是被測物質(zhì)的質(zhì)量數(shù)可精確到小數(shù)點(diǎn)后第3位。一般實(shí)測值與計(jì)算機(jī)給出的理論值相比較，取數(shù)值接近者。（四）核磁共振波譜（NMR）核磁共振：具有磁矩的(

1H、13C)原子核在磁場中吸收一定頻率的無線電波而發(fā)生核自旋能級躍遷的現(xiàn)象。核磁共振氫譜(1H-NMR)核磁共振碳譜(13C-NMR)二維核磁共振(2D-NMR)1