產(chǎn)品中的微生物檢驗(yàn)(食品、化妝品、藥品、環(huán)境等)

第七章

產(chǎn)品中的微生物檢驗(yàn)

（食品、化妝品、藥品、環(huán)境等）

CNASCMC第一節(jié)微生物檢驗(yàn)工作流程與質(zhì)量控制第二節(jié)食品的微生物學(xué)檢驗(yàn)第三節(jié)化妝品的微生物學(xué)檢驗(yàn)第四節(jié)藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)第五節(jié)環(huán)境的微生物學(xué)檢測第一節(jié)微生物檢驗(yàn)工作流程與質(zhì)量控制一、微生物檢驗(yàn)工作流程微生物檢驗(yàn)的一般程序包括：檢驗(yàn)前準(zhǔn)備、樣品的采集與送檢、樣品的預(yù)處理、樣品檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告在檢驗(yàn)過程中要遵循保證無菌要求，做到代表性、均勻性、程序性和適時性。（一）檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作1、準(zhǔn)備好檢驗(yàn)所需的各種儀器，如冰箱、恒溫水浴箱、滅菌鍋、顯微鏡等。2、各種玻璃儀器，如吸管、平皿、廣口瓶、試管等需洗凈和包扎后，采用濕熱（121℃、20min）或干熱（160~170℃、2h）滅菌，冷卻后送無菌室備用。3、準(zhǔn)備好試驗(yàn)所需的各種試劑、藥品、培養(yǎng)基，根據(jù)需要分裝、高壓蒸汽滅菌后置于46℃的恒溫水浴或保存在4℃的冰箱中備用。4、對超凈工作臺、無菌室等檢驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行滅菌；如用紫外燈法滅菌，時間不少于30min，關(guān)燈半小時后方可進(jìn)入工作；如用超凈工作臺，需提前半小時開機(jī)。必要時進(jìn)行無菌室的空氣檢驗(yàn)。5、檢驗(yàn)人員的工作衣、帽、鞋、口罩等滅菌后備用。工作人員進(jìn)入無菌室后，在試驗(yàn)沒完成前不得隨便出入無菌室。（二）樣品的采集與送檢1、樣品的采集在微生物檢驗(yàn)過程中，樣品的采集是極為重要的一個步驟。所采集的樣品必須具有代表性和均勻性，能反映全部被檢樣品的衛(wèi)生狀況，否則檢驗(yàn)結(jié)果將毫無價值，甚至?xí)霈F(xiàn)錯誤的結(jié)論。要求檢驗(yàn)人員不但要掌握正確的采樣方法，而且要了解樣品的批號、原料的情況、加工方法、保藏條件、運(yùn)輸、銷售中的各個環(huán)節(jié)及銷售人員的責(zé)任心和衛(wèi)生知識水平等。樣品可分為大樣、中樣、小樣三種：

大樣——一整批樣品

中樣——以隨機(jī)抽樣的方式從大樣各部分中取得的少量混合樣品

小樣——直接用于檢驗(yàn)的樣品，也稱檢樣一般根據(jù)檢驗(yàn)的目的、樣品種類、樣品性質(zhì)和分析方法確定科學(xué)的抽樣方案和合適的采樣數(shù)量。目前最為流行的抽樣方案為隨機(jī)抽樣方案和ICMSF（國際食品微生物學(xué)法規(guī)委員會）推薦的抽樣方案，有時也可參照同一產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗(yàn)抽樣數(shù)量抽樣，或按單位包裝件數(shù)N的開平方值抽樣。最常用的采樣方法是隨機(jī)抽樣，即均衡地、不加選擇地從全部產(chǎn)品的各個部分取少量樣品予以混合，從而保證所有物料各個部分被抽到的可能性均勻。采樣過程中必須在無菌操作條件下進(jìn)行，以防止交叉污染或二次污染，保持樣品原有的微生物狀態(tài)。采樣人員的個人衛(wèi)生控制；采樣地點(diǎn)的環(huán)境控制、空氣潔凈度要求；采樣工具（采樣器、剪刀、鑷子、開罐器等）、器皿（試管、廣口瓶等）要求徹底滅菌，避免直接與空氣接觸；采樣操作要嚴(yán)格無菌操作、規(guī)范、迅速等；采樣前后要及時貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽應(yīng)完整、清楚，注明樣品名稱、來源、數(shù)量、采樣地點(diǎn)、采樣人、采樣時間等。2、樣品的送檢采樣后，樣品應(yīng)及時送到微生物檢驗(yàn)室，越快越好，一般不超過3h，盡量減少樣品存放的時間。在送檢過程中，同樣要盡可能保持檢樣原有的微生物性狀，避免因送檢過程不當(dāng)造成微生物增加或減少。易變質(zhì)的樣品要冷藏，如果路途遙遠(yuǎn)，可將不需冷凍樣品保持在1~5℃環(huán)境中（如冰桶）；如需保持冷凍狀態(tài)，則需保存在泡沫塑料隔熱箱內(nèi)（箱內(nèi)有干冰，可維持0℃以下）；應(yīng)防止反復(fù)冷凍和融解。送檢樣品不得加入防腐劑。送檢時除以上注意事項(xiàng)外，還必須認(rèn)真填寫送檢申請單，以供檢驗(yàn)人員參考。內(nèi)容包括：樣品的描述，采樣人的姓名，生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)營者或銷售者的名稱和地址，采樣日期、時間、地點(diǎn)，采樣時的環(huán)境溫度和濕度等。（三）樣品的預(yù)處理樣品處理也是任何檢驗(yàn)工作中最重要的組成部分，以檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性來說，實(shí)驗(yàn)室收到的樣品是否具有代表性及其狀態(tài)如何是關(guān)鍵問題。如果采樣沒有代表性或?qū)悠返奶幚聿划?dāng)，得出的檢驗(yàn)結(jié)果都可能毫無意義。如果根據(jù)一小份樣品的檢驗(yàn)結(jié)果去說明一大批樣品的質(zhì)量，那么采取正確的樣品制備方法是必不可少的條件。樣品種類繁多，一般以液態(tài)和固態(tài)狀態(tài)存在。1、液體樣品先混合均勻，用無菌吸管吸取一定量樣品，通過無菌操作裝入瓶中裝有無菌稀釋液和適量玻璃珠的稀釋瓶中，用力振蕩混合均勻，或采用漩渦混勻器混勻。2、固體樣品（1）搗碎勻質(zhì)法：將一定量的檢樣放入無菌稀釋液的無菌均質(zhì)杯中以8000~10000r/min均質(zhì)1~2min，這是對大部分樣品都適用的方法。（2）剪碎法：將一定量的樣品剪碎，放入裝有無菌稀釋液和適量玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅不小于40cm。（3）研磨法：將一定量的樣品放入無菌乳缽中充分研磨后再放入帶有無菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。（4）拍擊式均質(zhì)法：也稱胃蠕動均質(zhì)法。這是國外常用、國內(nèi)近年來逐漸推廣使用的一種新型的均質(zhì)樣品的方法。即將一定量的樣品和稀釋液放入無菌均質(zhì)袋中，開機(jī)均質(zhì)。均質(zhì)器有一個長方形金屬盒，其旁安有金屬葉板，可拍擊塑料袋，金屬葉板由一恒速馬達(dá)帶動，作前后移動而撞碎樣品，達(dá)到較好的均質(zhì)效果。（5）棉拭采樣法：可用板孔5cm2的金屬制規(guī)板，壓在受檢物上，將滅菌棉拭稍沾濕，在板孔5cm2的范圍內(nèi)揩抹多次，然后將板孔規(guī)制板移壓另一點(diǎn)，用另一棉拭揩抹，如此共移壓揩抹10次，總面積50cm2，共用10支棉拭。每支棉拭在揩抹完畢后應(yīng)立即剪斷或燒斷后投入盛有50mL滅菌水的三角燒瓶或大試管中，立即送檢。檢驗(yàn)時先充分振搖吸取瓶、管中的液體，作為原液，再按要求作10倍遞增稀釋。該法常用于檢驗(yàn)肉禽及其制品受污染的程度。檢驗(yàn)致病菌，則不必用規(guī)板，在可疑部位用棉拭揩抹即可。（四）樣品的檢驗(yàn)檢驗(yàn)樣品送到實(shí)驗(yàn)室后，立即將樣品置于普通冰箱或低溫冰箱中，并進(jìn)行登記、填寫試驗(yàn)序號，按檢驗(yàn)要求，積極準(zhǔn)備條件進(jìn)行檢驗(yàn)。樣品收集后應(yīng)于36h內(nèi)檢驗(yàn)。在微生物檢驗(yàn)室必須備有專用冰箱存放樣品。一般陽性樣品，發(fā)出報(bào)告后3天（特殊情況可適當(dāng)延長）方能處理樣品。進(jìn)口樣品的陽性樣品，需保存6個月，方能處理。陰性樣品可及時處理。（五）結(jié)果報(bào)告按樣品項(xiàng)目完成各類檢驗(yàn)后，檢驗(yàn)人員應(yīng)及時填寫報(bào)告單，簽名后送主管人員核實(shí)簽字，加蓋單位印章，以示生效，立即交相關(guān)衛(wèi)生監(jiān)督人員處理。二、微生物檢測的質(zhì)量控制為了滿足微生物檢測質(zhì)量要求，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須遵循誠信公正、求真務(wù)實(shí)的質(zhì)量方針，首先應(yīng)建立一套行之有效的質(zhì)量控制體系。包括：1、樣品的管理：樣品應(yīng)正確采樣，并有充分的代表性，嚴(yán)格按照無菌操作要求采樣，且送檢樣品的標(biāo)識應(yīng)是唯一的，同時要做好樣品的交接登記保存及處置等工作。送檢樣品盡快檢驗(yàn)，避免樣品保存時污染、腐敗變質(zhì)，影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2、檢驗(yàn)方法：微生物檢驗(yàn)應(yīng)按國家衛(wèi)生檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法或其他實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的方法進(jìn)行。3、檢驗(yàn)過程：檢驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)程，每個樣本要做空白對照和平行樣，以保證微生物檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。4、報(bào)告制度：每張報(bào)告應(yīng)有檢驗(yàn)者、審核者、簽發(fā)者的簽名，并附有檢驗(yàn)原始記錄，以盡量避免錯誤的檢查報(bào)告，保證結(jié)果的可靠性和可溯源性。5、完善實(shí)驗(yàn)室管理：建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)審制度，及時更新程序文件，以不斷提高衛(wèi)生檢驗(yàn)管理水平，完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系。在實(shí)施過程中，微生物檢測的質(zhì)量控制點(diǎn)主要有以下幾點(diǎn)：1、實(shí)驗(yàn)室2、人員3、設(shè)備儀器4、培養(yǎng)基、試劑1、實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室要具有適宜、足夠?qū)挸?、通風(fēng)良好的照明。房屋內(nèi)墻面及地面等應(yīng)采用易于清潔的材料，以保持房間清潔。微生物潔凈室等專用工作室要具有標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和定期的檢測校準(zhǔn)程序。潔凈室應(yīng)定期進(jìn)行風(fēng)速監(jiān)測和及時更換過濾層罩，條件有限的實(shí)驗(yàn)室可使用超凈工作臺。實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境應(yīng)滿足檢測要求，需具備相應(yīng)環(huán)境設(shè)施的相關(guān)技術(shù)指標(biāo)，不能影響檢測結(jié)果的可靠性、有效性和準(zhǔn)確性。樣品保存室、培養(yǎng)室，其溫度、濕度應(yīng)每天進(jìn)行監(jiān)控并有記錄。無菌室等特殊環(huán)境對微生物指標(biāo)進(jìn)行控制并記錄；凈化室、凈化工作區(qū)域、潔凈環(huán)境應(yīng)按國家及部頒標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測。定期進(jìn)行紫外線強(qiáng)度和空氣質(zhì)量監(jiān)測，每月要至少檢測一次空氣潔凈度指標(biāo)。與微生物檢驗(yàn)室相鄰區(qū)域如有互不相容的活動時，應(yīng)進(jìn)行有效的隔離，并采取措施防止交叉污染。2、人員要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量，首先應(yīng)重視檢驗(yàn)人員的科學(xué)技術(shù)素養(yǎng)，為技術(shù)人員及時了解當(dāng)今的科技進(jìn)步信息和掌握先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)創(chuàng)造條件。微生物檢驗(yàn)人員應(yīng)具有較強(qiáng)的專業(yè)知識和相應(yīng)的技術(shù)技能，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)工作態(tài)度，在工作中嚴(yán)格按照相應(yīng)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量要求來進(jìn)行操作。檢驗(yàn)人員應(yīng)經(jīng)常參加培訓(xùn)交流，及時了解和掌握微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域新的進(jìn)展和動態(tài)，以豐富積累工作經(jīng)驗(yàn)，提高檢驗(yàn)水平。3、儀器設(shè)備微生物檢驗(yàn)室常用的儀器設(shè)備主要有冰箱、培養(yǎng)箱、干燥箱、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、pH計(jì)、溫度計(jì)、紫外燈、顯微鏡、離心機(jī)、天平、微生物測定儀器、微生物檢定儀器、空氣采樣器、酶標(biāo)儀等。對于連續(xù)工作的儀器如冰箱、培養(yǎng)箱，每天都要對其進(jìn)行溫度監(jiān)控和記錄并定期維護(hù)。儀器設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行檢定校準(zhǔn)，一般半年或一年一次。儀器的檢定應(yīng)按到關(guān)部門進(jìn)行或按自校作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行。儀器的使用登記、校準(zhǔn)計(jì)劃、校準(zhǔn)記錄等文件要存檔。儀器要做到專人使用，操作者應(yīng)取得相應(yīng)的崗位培訓(xùn)合格證。4、培養(yǎng)基、試劑培養(yǎng)基、試劑的購買，應(yīng)要求供貨商出具“三證”。培養(yǎng)基和試劑使用前通過外觀（研細(xì)程度、溶解前后的顏色、透明度、雜質(zhì)等）、批號、pH值、選擇性等進(jìn)行初步評估，檢查培養(yǎng)基和試劑是否合格，是否在保質(zhì)期內(nèi)。培養(yǎng)基和試劑的配制應(yīng)有記錄可查，培養(yǎng)基應(yīng)按要求選擇合適的壓力和時間進(jìn)行滅菌，并且應(yīng)有高壓滅菌效果的監(jiān)測記錄。配制培養(yǎng)基原料的優(yōu)劣直接影響到培養(yǎng)基的質(zhì)量，也必將影響檢驗(yàn)質(zhì)量。控制pH值、無菌試驗(yàn)、陽性對照做質(zhì)控。培養(yǎng)基和試劑的儲存應(yīng)按照其說明的儲存條件來保存，配制好的培養(yǎng)基保存環(huán)境為4℃冰箱。不同批號的培養(yǎng)基和試劑不能混合使用。微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備微生物檢驗(yàn)所需的所有試劑、診斷學(xué)清和標(biāo)準(zhǔn)菌株，試劑和診斷學(xué)清應(yīng)注明其有效期，并定期用標(biāo)準(zhǔn)菌株監(jiān)測其敏感性和特異性，而標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)注意妥善保存，專人保管，并做好菌種領(lǐng)取使用和銷毀的登記記錄。各種細(xì)菌鑒定用生化培養(yǎng)基在有效期內(nèi)，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。試劑使用前必須以陽性菌株測試，革蘭氏染色液可用金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌作為質(zhì)控菌。第二節(jié)食品的微生物學(xué)檢驗(yàn)現(xiàn)代食品必須具備三個基本要求：安全性、營養(yǎng)性、感官要求對食品進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)是食品檢測必不可少的重要組成部分：1、它是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是判定被檢食品能否食用的科學(xué)依據(jù)之一。2、通過食品微生物學(xué)檢驗(yàn)，可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生情況，從而能夠?qū)κ称繁患?xì)菌污染的程度作出正確的評價，為各項(xiàng)衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)。3、食品微生物檢驗(yàn)是以貫徹“預(yù)防為主”的衛(wèi)生方針，可以有效地防止或者減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生，保障人民的身體健康。4、食品微生物檢驗(yàn)對提高產(chǎn)品質(zhì)量、避免經(jīng)濟(jì)損失等方面具有重大意義。一、食品微生物檢驗(yàn)的范圍食品從生產(chǎn)原料、加工、儲運(yùn)到銷售等全過程，都可能遭受微生物的污染。根據(jù)食品被微生物污染的原因和途徑，食品微生物檢驗(yàn)的范圍包括以下幾點(diǎn)：1、生產(chǎn)環(huán)境的檢驗(yàn)：包括車間用水、空氣、地面、墻壁等。2、原輔料的檢驗(yàn)：包括動植物、食品添加劑等一切原輔材料。3、食品加工、儲藏、銷售各環(huán)節(jié)的檢驗(yàn)：包括食品從業(yè)人員的衛(wèi)生狀況檢驗(yàn)、加工工具、運(yùn)輸車輛、包裝材料的檢驗(yàn)等。4、食品的檢驗(yàn)：特別是對出廠食品、可疑食品及食物中毒食品的檢驗(yàn)。二、食品微生物檢驗(yàn)的指標(biāo)我國衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標(biāo)主要有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。1、菌落總數(shù)菌落總數(shù)是指被檢樣品經(jīng)過預(yù)處理后，在一定條件下培養(yǎng)后所得的單位重量（g）、容積（mL）或表面積（cm2）樣品內(nèi)所形成的細(xì)菌菌落的總數(shù)。它可以反映食品的新鮮度、被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，及時判定食品加工過程是否符合衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評價提供依據(jù)。2、大腸菌群大腸菌群指一群在37℃培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。這類細(xì)菌是溫血動物腸道中的正常菌群，主要包括大腸埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和檸檬酸桿菌屬等。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，大腸菌群作為食品、水質(zhì)等糞便污染指標(biāo)菌來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量。3、致病菌致病菌指能夠引起人們發(fā)病的細(xì)菌，對不同的食品和不同的場合，應(yīng)該選擇一定的參考菌群進(jìn)行檢驗(yàn)。海產(chǎn)品——副溶血性弧菌蛋與蛋制品——沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌米、面類食品——蠟樣芽孢桿菌、變形桿菌、霉菌罐頭食品——耐熱性芽孢菌4、霉菌及其毒素我國還沒有制定出霉菌的具體指標(biāo)，但由于許多霉菌能夠產(chǎn)生毒素，引發(fā)食源性疾病、癌癥等，因此也應(yīng)該對產(chǎn)毒霉菌進(jìn)行檢驗(yàn)。曲霉屬的黃曲霉、寄生曲霉等，青霉屬的橘青霉、島青霉等，鐮刀霉屬的串珠鐮刀霉、河谷鐮刀霉等。5、其他指標(biāo)微生物指標(biāo)還應(yīng)包括病毒和寄生蟲。肝炎病毒、諾沃克病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒等。旋毛蟲、囊尾蚴、孢子蟲、蛔蟲、中華分支睪吸蟲等。在某些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中，也規(guī)定其他微生物作為指標(biāo)。低酸食品——大腸桿菌冷凍食品——腸球菌酵母菌和/或霉菌三、食品微生物檢驗(yàn)的一般程序檢驗(yàn)前準(zhǔn)備工作采集樣品樣品預(yù)處理細(xì)菌總數(shù)大腸菌群致病菌分離培養(yǎng)前增菌分離培養(yǎng)純化生化試驗(yàn)動物試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)染色鏡檢其他試驗(yàn)報(bào)告（一）食品檢樣的采集與制備通過設(shè)計(jì)一種科學(xué)的取樣方案及采取正確的樣品制備方法，從而做到以小見大，即根據(jù)一小份樣品的檢驗(yàn)結(jié)果去說明一大批食品的質(zhì)量或一起食物中毒的性質(zhì)。要保證樣品的代表性，首先要有一套科學(xué)的抽樣方案，檢驗(yàn)?zāi)康牟煌?，采樣方案也不同。檢驗(yàn)?zāi)康囊话阌信卸ㄒ慌称泛细衽c否；查找食物中毒病原微生物；鑒定畜禽產(chǎn)品中是否含有人畜共患病的病原體等。其次使用正確的抽樣技術(shù)，最常用隨機(jī)抽樣的方式，即在生產(chǎn)過程中，在不同時間內(nèi)隨機(jī)抽取一定數(shù)量的少量樣品予以混合，保證不同部位被抽取的可能性是均等的。不同形態(tài)、種類的食品，其采樣的數(shù)量是不一樣的，應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)進(jìn)行合理選擇。樣品種類可分為大樣、中樣和小樣。大樣指一整批食品，中樣是指由整批大樣的各個部分采取的混合樣品，小樣是指直接進(jìn)行分析的檢樣，定型包裝和散裝食品采樣量一般為250g。在采樣過程中，最好對整批產(chǎn)品的單位包裝編號，對所抽樣品進(jìn)行及時、準(zhǔn)確的標(biāo)記，應(yīng)注明樣品名稱、采樣地點(diǎn)、采樣日期、樣品批號、采樣方法、采樣數(shù)量、檢驗(yàn)項(xiàng)目及采樣人。標(biāo)記應(yīng)牢固，具防水性，字跡不會被擦掉或脫色。在樣品的抽樣、保存、運(yùn)輸過程中防止食品中原有微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化，要防止一切外來污染。采樣和樣品制備時必須嚴(yán)格無菌操作。抽樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應(yīng)當(dāng)徹底滅菌，一件采樣用具只能用于一個樣品，以防止交叉污染。（二）食品檢樣的預(yù)處理由于食品檢樣種類繁多、成分復(fù)雜，要根據(jù)食品種類的不同性狀和特點(diǎn)，采取相應(yīng)的預(yù)處理方法，制備成稀釋液才能進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的檢驗(yàn)。樣品處理應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，若是冷凍樣品，必須事先在原容器中解凍，解凍溫度為2~5℃不超過18h或45℃不超過15min。接種量為25g（mL），采用十倍稀釋法進(jìn)行樣品稀釋。預(yù)處理方法中以均質(zhì)法效果最好。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：使微生物從食品顆粒上脫離，在液體中分布均勻；食品中營養(yǎng)物質(zhì)可以更多地釋放到液體中，有利于微生物的生長。在選擇制備方法時要合理地選擇最佳的方式，如黏度不超過牛乳的非黏性食品、黏性液體食品和不易混合的檢樣最好放在均質(zhì)器中加入稀釋液進(jìn)行均質(zhì)，以保證均勻性；能與水混合的檢樣則可采用手振蕩或機(jī)器振蕩。（三）食品檢樣的保存及送檢為確保檢驗(yàn)結(jié)果的適時性，樣品采集后，應(yīng)由抽樣人寫出完整的抽樣報(bào)告，使樣品盡可能保持在原有條件下迅速發(fā)送到實(shí)驗(yàn)室，一般不超過36h送檢，且最好由專人立即送檢。當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職抽樣人員運(yùn)送時，必須將樣品包裝好，應(yīng)能防破損、防凍結(jié)或防腐，防止冷凍樣品升溫或熔化；在包裝上應(yīng)注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字樣；同時作好樣品運(yùn)送記錄，寫明運(yùn)送條件、日期、到達(dá)地點(diǎn)及其他需要說明的情況，并由運(yùn)送人簽字。如不能及時運(yùn)送，冷凍樣品應(yīng)保持冷凍狀態(tài)，應(yīng)存放在冰箱或冷藏庫內(nèi)；冷卻和易腐食品存放在0~5℃冰箱或冷卻庫內(nèi)；其他食品可放在常溫冷暗處。運(yùn)送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑，保證途中樣品不升溫或不熔化。必要時可于途中不加冷卻劑或冷凍劑。盛樣品的容器應(yīng)消毒處理，但不得用消毒劑處理容器，不能在樣品中加入任何防腐劑。（四）食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)技術(shù)1、菌落總數(shù)2、大腸菌群3、致病菌——大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等4、霉菌和酵母菌5、微生物快速檢測技術(shù)1、菌落總數(shù)菌落總數(shù)指食品檢樣經(jīng)處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1mL食品檢樣（對包裝材料、設(shè)備和用具表面用1cm2面積）所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，單位應(yīng)記為cfu/g（mL）。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)——菌落總數(shù)測定》中規(guī)定的平板菌落計(jì)數(shù)法。所得結(jié)果只包括一群能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的中溫需氧菌的菌落數(shù)，計(jì)數(shù)總比實(shí)際存在的細(xì)菌數(shù)少。檢測食品中的菌落總數(shù)有以下兩個方面的衛(wèi)生學(xué)意義：（1）食品中菌落總數(shù)可作為判定食品被污染程度的指標(biāo)。（2）菌落總數(shù)可用于觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)，用來預(yù)測食品的保存期。評定食品的新鮮度和衛(wèi)生質(zhì)量除了菌落總數(shù)外，還必須配合大腸菌群的檢驗(yàn)和病原菌等項(xiàng)目的檢驗(yàn)，才能作出比較全面準(zhǔn)確的評定。還有一些食品，如酸泡菜、發(fā)酵乳等發(fā)酵制品，在進(jìn)行平板計(jì)數(shù)時應(yīng)排除有關(guān)的微生物，也不能單憑測定菌落總數(shù)來確定衛(wèi)生質(zhì)量，因?yàn)榘l(fā)酵制品本身就是通過微生物的作用而制成的。2、大腸菌群大腸菌群是指一群在37℃、24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群主要是由腸桿菌科中四個菌屬內(nèi)的一些細(xì)菌所組成，即埃希氏菌屬（Escherichia）、枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）及腸桿菌屬（Enterobacter）。測定大腸菌群的衛(wèi)生學(xué)意義：（1）可作為糞便污染的指標(biāo)菌（2）可作為腸道致病菌污染食物的指標(biāo)大腸菌群檢驗(yàn)結(jié)果均采用每100mL（g）樣品中大腸菌群最近似數(shù)（或最可能數(shù)）來表示：MPN/100mL（g）。我國國標(biāo)GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)——大腸菌群測定》規(guī)定采用九管乳糖發(fā)酵的三步檢驗(yàn)法，即乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。3、致病菌致病菌系指腸道致病菌、致病性球菌等。幾乎所有食品標(biāo)準(zhǔn)都規(guī)定致病菌不得檢出。食品中致病菌的檢驗(yàn)主要包括食品原料及食品中各種病原菌的檢驗(yàn)，如致病性大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肉毒梭菌及毒素等19種病原菌。4、霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌廣泛存在于自然環(huán)境中，它們在食品中可作為正常菌群的一部分，也常作為食品腐敗菌侵染各類食品和糧食，使之發(fā)生腐敗變質(zhì)。有些霉菌的有毒代謝產(chǎn)物會引起各種急性和慢性中毒，特別是有些霉菌毒素具有強(qiáng)烈的致癌性，一次大量或長期少量攝入，均能誘發(fā)癌癥。霉菌和酵母菌的測定是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1mL檢樣中所含的霉菌和酵母菌落數(shù)（糧食樣品是指1g糧食表面的霉菌總數(shù)）。5、微生物快速檢測技術(shù)（1）細(xì)菌總數(shù)快速檢驗(yàn)方法紙片快速測定法、電阻抗法、旋轉(zhuǎn)平板法、ATP生物熒光法（2）大腸菌群快速檢驗(yàn)方法LTSE快速檢測法、紙片快速測定法、TTC（氯化三苯四氮唑）顯色快速法、DC（去氧膽酸鈉）半固體試管快速法（3）沙門氏菌（4）大腸桿菌O157：H7（5）金黃色葡萄球菌第三節(jié)化妝品的微生物學(xué)檢驗(yàn)一、概述二、化妝品的衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)三、化妝品的采集與預(yù)處理四、化妝品的衛(wèi)生細(xì)菌檢驗(yàn)一、概述化妝品是指以涂擦、噴灑或者其他類似的方法，散布于人體表面任何部位（皮膚、毛發(fā)、指甲、口唇等），以達(dá)到清潔、消除不良?xì)馕?、護(hù)膚、美容和修飾目的的日化產(chǎn)品。（一）化妝品微生物污染來源1、生產(chǎn)過程的污染（從原料到產(chǎn)品）

一次污染，主要是天然的動植物成分及其提取物，增稠劑、天然膠質(zhì)、粉體、離子交換水、表面活性劑等。2、設(shè)備、生產(chǎn)用具污染

儲存罐、攪拌器、研磨機(jī)、灌裝設(shè)備等。3、生產(chǎn)環(huán)境中受到污染

廠房空氣和生產(chǎn)人員。（二）微生物在化妝品中的生長與繁殖1、化妝品營養(yǎng)成分與微生物的關(guān)系碳源、氮源和礦物質(zhì)2、化妝品中的水分與微生物的關(guān)系決定微生物能否生長和影響生長速度3、化妝品的酸堿度、濕度等與微生物的關(guān)系化妝品的pH約在4~7之間，適宜微生物生長；化妝品的生產(chǎn)、儲藏和使用溫度與微生物生長溫度基本一致。（三）不同種類化妝品的染菌特點(diǎn)1、膏霜類（護(hù)膚類）污染率最高，污染的微生物種類也最多。檢出率較高的有糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌，此外還檢出有蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌、沙門氏菌、腸桿菌屬等。2、發(fā)用類富含水分和各種營養(yǎng)物質(zhì)，洗發(fā)水的主要成分烷基硫酸鹽等較易繁殖綠膿桿菌等細(xì)菌和霉菌。3、粉類干燥，污染率較低，污染來源主要是原料，檢出較多的是抵抗力較強(qiáng)的需氧芽孢菌。4、美容類制造過程中經(jīng)過高溫熔融，染菌量不應(yīng)高。此類化妝品的微生物污染對人健康影響最大，特別是用于眼周圍的眼部化妝品和唇膏等。二、化妝品的衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)不得對施用部位產(chǎn)生明顯刺激和損傷；必須使用安全且無感染性?；瘖y品衛(wèi)生規(guī)范對其微生物學(xué)質(zhì)量規(guī)定了對眼部、口唇等黏膜用以及嬰兒和兒童用化妝品以及其他化妝品的細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)限值，并不得檢出糞大腸菌群、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌。檢驗(yàn)項(xiàng)目指標(biāo)菌落總數(shù)/（cfu/g）≤500或1000霉菌和酵母菌總數(shù)/（cfu/g）≤100致病菌（糞大腸菌群、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌）不得檢出三、化妝品的采集與預(yù)處理（一）樣品的采集化妝品所采樣品也應(yīng)有代表性和均勻性。對每批生產(chǎn)的樣品應(yīng)隨機(jī)從任意兩個以上的大樣中隨機(jī)抽取兩個以上的包裝單位（瓶、盒）作為中樣。檢驗(yàn)時從兩個或兩個以上的中樣中抽取10g或10mL混合成一個檢樣進(jìn)行檢驗(yàn)。樣品包裝上的名稱、標(biāo)簽等均應(yīng)與市場銷售樣品相同。凡檢出化妝品衛(wèi)生規(guī)范中規(guī)定的控制菌和致病菌時，要嚴(yán)格按檢驗(yàn)要求準(zhǔn)確鑒定，待確定無誤時，再出結(jié)果報(bào)告，報(bào)告發(fā)出后不再留樣或重新送（?。訌?fù)檢。（二）樣品的預(yù)處理化妝品樣品與其他樣品的不同之處：一是化妝品中通常都加有防腐劑，二是化妝品的劑型較多且復(fù)雜。1、殘留防腐劑的去除原則：能有效去除化妝品中殘留的防腐劑；對微生物無害，不減少微生物的檢出效果；不破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，不影響其理化性能。方法：化學(xué)中和法、稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾沖洗法等2、供檢樣品的制備原則：無菌操作、樣品充分混合均勻、樣品完全溶解。四、化妝品的衛(wèi)生細(xì)菌檢驗(yàn)化妝品作為特殊商品，微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目主要有菌落總數(shù)、糞大腸菌群、致病菌（綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌）。（一）菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法、菌落計(jì)數(shù)方法及報(bào)告方式與食品檢樣相似，不同點(diǎn)在于需要往營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中添加卵磷脂、吐溫80以中和化妝品中的防腐劑。（二）糞大腸菌群糞大腸菌群是一群需氧及兼性厭氧，在44.5℃培養(yǎng)24~48h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。若從化妝品中檢出糞大腸菌群，表明該產(chǎn)品受到糞便污染，可能存在腸道致病微生物并引起疾病，是評價化妝品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。國際上廣泛用此菌作為衛(wèi)生指示菌。化妝品中的糞大腸菌群的檢測方法與食品檢樣相似。（三）綠膿桿菌的檢測綠膿桿菌，即銅綠色假單胞菌，也稱綠膿假單胞菌，可產(chǎn)生藍(lán)綠色素和熒光色素。一般情況下該菌不致病，在特殊條件下可引起皮膚化膿感染、泌尿道感染、中耳炎等。外傷及燒傷患者感染后最易引起化膿，并可引起敗血癥?；瘖y品中不應(yīng)檢出綠膿桿菌。根據(jù)綠膿桿菌的生物學(xué)特征對其進(jìn)行鑒定檢驗(yàn)：革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素，可液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃下能生長等。我國化妝品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中規(guī)定十六烷三甲基溴化胺和乙酰胺兩種培養(yǎng)基均可使用。（四）金黃色葡萄球菌的檢測金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽孢，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對人類致病力最強(qiáng)的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴(yán)重時可導(dǎo)致敗血癥，所以化妝品中不得檢出金黃色葡萄球菌。根據(jù)本菌特有的形態(tài)及培養(yǎng)特征，應(yīng)用Baird-Parker平板進(jìn)行分離，該平板中的氯化鋰可抑制革蘭氏陰性細(xì)菌生長，丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長，以提高檢出率，并利用分解甘露醇和血漿凝固酶等特征，以茲鑒別。第四節(jié)藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)一、藥品無菌檢查法二、微生物限度檢查法一、藥品無菌檢查法無菌檢查法是針對無菌或滅菌藥品、敷料及器械等的無菌可靠性而建立的檢查法，即藥品、敷料及器械等無菌的可靠性可通過無菌檢查來確認(rèn)，而無菌檢查的可信度與抽樣量、檢查用的培養(yǎng)基質(zhì)量、材料、操作環(huán)境、無菌技術(shù)等有關(guān)。（一）無菌檢查的概念及范圍1、無菌檢查的概念無菌檢查是指檢查無菌或滅菌制品、敷料、縫合線、無菌器具及適用于藥典要求無菌檢查的其他品種是否無菌的一種方法。凡進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)、肌肉、皮下組織或接觸創(chuàng)傷、潰瘍等部位而發(fā)生作用的制品或要求無菌的材料、滅菌器具等都要進(jìn)行無菌檢查。2、無菌檢查的范圍各種注射劑、眼用及外傷用制劑、植入劑、可吸收的止血劑、外科用敷料、器材。上述各類制劑均不得檢出需氧菌、厭氧菌及真菌等任何類型的活菌。無菌檢查的結(jié)果為無菌時，在一定意義上講，它要受抽驗(yàn)樣本數(shù)量的限制，同時也要受滅菌工藝的限制，對最終滅菌品達(dá)到10-6的微生物存活概率，就認(rèn)為滅菌品合格。所以并非絕對無菌，這個結(jié)果也是相對意義的。（二）培養(yǎng)基及培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)1、無菌檢查用培養(yǎng)基（1）需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（2）真菌培養(yǎng)基：藥典規(guī)定的真菌培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基（3）選擇性培養(yǎng)基：對氨基苯甲酸培養(yǎng)基（用于磺胺類藥物的無菌檢查）；聚山梨酸培養(yǎng)基（用于油劑藥品的無菌檢查）。2、培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)（1）菌種：中國藥典與英、美藥典規(guī)定的菌種，需氧菌有藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、銅綠假單胞菌；厭氧菌有生孢梭菌和普通擬桿菌；真菌有白色念珠菌和黑曲霉。加菌量皆在10~100個之間。（2）細(xì)菌計(jì)數(shù)方法：采用細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濃度比濁法和原菌培養(yǎng)液直接稀釋法。（3）培養(yǎng)基臨用前的檢查：需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基在臨用前必須做檢查，培養(yǎng)基上部約1/10~1/15處呈現(xiàn)淡紅色時可以使用，若淡紅色部分超過1/3高度時，應(yīng)將培養(yǎng)基用水浴或其他方法加熱，直到無色后，冷卻至45℃以下時再立即接種待檢品。但用沸水加熱法去除培養(yǎng)基內(nèi)游離氧時，每批培養(yǎng)基只限加熱一次，否則影響培養(yǎng)基的質(zhì)量。全管呈現(xiàn)淡紅色時，不得再用。（三）陽性對照菌及抑細(xì)菌、抑真菌試驗(yàn)1、陽性對照菌陽性對照菌是為供試品做陽性對照試驗(yàn)使用的。陽性對照試驗(yàn)的目的是檢查陽性菌在加入供試品的培養(yǎng)基中能否生長，以驗(yàn)證供試品有無抑菌活性物質(zhì)和試驗(yàn)條件下是否符合要求。陽性菌生長表明使用的技術(shù)條件恰當(dāng)，反之，試驗(yàn)無效。因此，無論有無抗菌活性的供試品都應(yīng)做陽性對照試驗(yàn)，以此作為評定檢查方法的可行性的重要依據(jù)。2、抑細(xì)菌和抑真菌試驗(yàn)在用直接接種法無菌檢查前，必須對供試品的抑菌性有所了解。為此，可用如下方法測定供試品是否具有抑細(xì)菌和抑真菌作用。用需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基4管及真菌培養(yǎng)基2管，分別接種金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌均10~100個菌各2管，其中1管加供試品規(guī)定量，所有培養(yǎng)基管置規(guī)定的溫度，培養(yǎng)3~5天。如培養(yǎng)基各管24h內(nèi)微生物生長良好，則供試品無抑菌作用。如加供試品的培養(yǎng)基管與未加供試品的培養(yǎng)基管對照比較，微生物生長微弱、緩慢或不生長，均判為供試品有抑菌作用。該供試品需用稀釋法（相同量的供試品接種入較大量培養(yǎng)基中）或中和法、薄膜過濾法處理，消除供試品的抑菌性后，方可接種至培養(yǎng)基。（四）無菌檢查方法各國藥典的無菌檢查法均包括：直接接種法和薄膜過濾法。前者適用于非抗菌作用的供試品；后者適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。無菌檢查均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作，作陰性對照。陰性對照的目的是檢查取樣用的吸管、針頭、注射器、稀釋劑、溶劑、沖洗液、過濾器等是否無菌，同時也是對無菌檢查區(qū)域及無菌操作技術(shù)等條件的測試。二、微生物限度檢查法（一）藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)微生物限度規(guī)定的作用是為藥品生產(chǎn)提供一個標(biāo)準(zhǔn)或指導(dǎo)，以確保藥品使用的安全。各國藥典標(biāo)準(zhǔn)分為強(qiáng)制性的（要求無菌）和非強(qiáng)制性的（允許有一定數(shù)量的菌）可達(dá)到的限度標(biāo)準(zhǔn)，這些指標(biāo)正確、有效地規(guī)范了藥品生產(chǎn)、核定和監(jiān)督的程序。（二）供試品的制備1、供試品的檢查量（1）抽樣：供試品應(yīng)按批號隨機(jī)抽樣，抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個以上最小包裝單位）的3倍量。（2）檢驗(yàn)量：每批供試品的檢驗(yàn)量，固體制劑為10g，液體制劑為10mL，外用的軟膏、栓劑、眼膏劑等為5g，膜劑為10cm2；貴重或極微量包裝的藥品，口服固體制劑不得少于3g，液體制劑不得少于3mL，外用藥不得少于5g。（3）取樣數(shù)：供試品均需取自2個以上的包裝單位，膜劑還應(yīng)取自4片以上樣品，中藥蜜丸至少應(yīng)取4丸以上，共10g。2、一般供試品的制備（1）固體供試品：稱取10g，置研缽中，以100mL稀釋劑分次加入，研磨細(xì)勻，使成1:10供試液。對吸水膨脹或黏度大的供試品，可制成1:20的供試液。（2）液體供試品：量取10mL，加入90mL稀釋劑中，使成1:10供試液。合劑（含王漿、蜂蜜等）滴眼劑可以原液為供試液。（3）軟膏劑、乳膏劑等非水溶性制劑：稱取供試品5g，置乳缽或燒杯中，加8mL滅菌吐溫80，充分研勻，加入西黃蓍膠或羧甲基纖維素2.5g，充分研勻，加92mL45℃的稀釋劑，邊加邊研磨，使成均勻的乳劑，即成1:20供試液?；蚍Q取供試品5g，加滅菌液體石蠟20mL，研勻，加吐溫8020mL，研勻，將60mL稀釋劑少量多次加入，邊加邊研磨，使充分乳化，即得1:20供試液。（4）難溶的膠囊劑、膠丸劑、膠劑等：可將供試品加稀釋劑在45℃水浴中保溫、振搖、助溶，使成1:10供試液。（三）細(xì)菌總數(shù)的測定1、測定方法采用平板菌落計(jì)數(shù)