測序技術研究進展

基因測序技術原理及進展基因測序

滿足高通量、高效率、高覆蓋度(序列組成)基因檢測

精準、明確的目標片段、個體差異（功能解釋）測序與檢測1975/19771985/19871990/2003測序技術發(fā)展時間軸測序技術的歷史進程第1代測序技術——熒光標記Sanger法第2代測序技術——循環(huán)陣列合成測序法第3代測序技術——單分子測序法代次第一代第二代第三代版本1.11.22.12.22.33.13.2Sanger法ABIABI/GenoMeMSCompleteGenomicsSBS合成法測序IlluminaSBL連接法測序ABI/PolonatorG.007SBP焦磷酸測序RocheSM-SBSFDHelicosFEPacificBioscience/VisiGen納米OxfordNanopore測序技術發(fā)展路線

化學裂解法

雙脫氧鏈終止法

熒光自動測序法

雜交測序法第1代測序技術

——熒光標記Sanger法G1.1化學裂解法對待測DNA5’末端進行放射性標記利用化學試劑在原DNA鏈某一種或某一類堿基處進行專一性切割。設計4組相互獨立的化學反應分別得到部分降解產(chǎn)物。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，放射自顯影檢測獲取核苷酸序列。G1.2雙脫氧鏈終止法放射性標記的4種dNTP混合底物中的一種每次將一種2′3′-雙脫氧核苷酸(ddNTP)摻入到底物混合反應液中參與DNA鏈的合成設計4組相互獨立的聚合反應分別得到不同末端終止的合成片段產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，放射自顯影檢測獲取核苷酸序列。

讀出模板互補序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測序列CTGACTTCGACAAACAA5′3′ACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′在1985年,Smith等采用激光激發(fā)標記的熒光,并用CCD檢測20世紀80年代初Jorgenson和Lukacs提出了毛細管電泳技術1992年美國的Mathies實驗室首先提出陣列毛細管電泳(capillaryarrayelectrophoresis)新方法,并采用激光聚焦熒光掃描檢測裝置,25只毛細管并列電泳,每只毛細管在1.5h內(nèi)可讀出350bp,DNA序列分析效率可達6000bp/h。G1.3熒光自動測序技術目前,應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems,ABI)3730系列自動測序儀即是基于毛細管電泳和熒光標記技術的DNA測序儀,用CCD檢測系統(tǒng)識別,并直接翻譯DNA序列。310型全自動遺傳分析儀其他DNA全自動分析儀：ABIPrism?3100遺傳分析儀

3700型全自動遺傳分析儀ABI3500測序儀G1.4雜交測序技術20世紀80年代末出現(xiàn),利用DNA雜交原理,將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上,把待測的DNA樣品片段變性后與其雜交,根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。優(yōu)點：檢測速度快,檢測成本低,具有部分第二代測序技術的特點。缺點：誤差較大,且不能重復測定。第一代總結通過幾十年的逐步改進,第1代測序儀的讀長可以超過1000bp,原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99.999%,測定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達到600,000堿基.由于其對電泳分離技術的依賴,使其難以進一步提升分析的速度和提高并行化程度,并且難以通過微型化降低測序成本.因此,需要開發(fā)全新的技術來突破這些局限.第2代測序技術

——循環(huán)陣列合成測序法第二代測序技術都采用了大規(guī)模矩陣結構的微陣列分析技術——陣列上的DNA樣本可以被同時并行分析.此外,測序是利用DNA聚合酶或連接酶以及引物對模板進行一系列的延伸,通過顯微設備觀察并記錄連續(xù)測序循環(huán)中的光學信號實現(xiàn)的.第2代測序技術工作流程測序儀品牌技術原理開發(fā)商Roche454焦磷酸測序RocheIlluminaSolexa邊合成邊測序IlluminaABISOLiD基于磁珠的大規(guī)模并行連接測序ABI第二代測序技術的關鍵特點：第一,通過有序或者無序的陣列配置實現(xiàn)大規(guī)模的并行化,以提供高程度的信息密度;第二,不采用電泳設備易于微型化.相對于第1代測序技術,樣本和試劑的消耗量得以降低.G2.1焦磷酸測序核心技術：“微乳粒PCR”——油包水結構乳粒酶化學發(fā)光反應原理：利用微乳滴PCR(emulsionPCR,emPCR)來生成擴增產(chǎn)物.利用水溶液與油混合形成油包水結構乳滴進行后續(xù)PCR反應的微型化學反應.堿基測定采用邊合成邊測序,利用焦磷酸法產(chǎn)生的光學信號來進行檢測.在三磷酸核苷結合到DNA鏈上的時候釋放焦磷酸,通過ATP硫?；负蜔晒馑孛府a(chǎn)生一系列級聯(lián)反應,導致生物化學發(fā)光放出光信號.優(yōu)點：焦磷酸測序的主要優(yōu)勢是它的速度和讀長（將近500堿基）。除了DNA聚合酶反應所需化合物,焦磷酸測序法并不需要額外的化合物用于DNA鏈的延長,降低了化學反應出現(xiàn)意外的幾率。缺點:這一技術平臺主要的錯誤類型來自于同聚物，即相同堿基的延伸,另一個缺點是由于它依賴于包含一系列酶的焦磷酸檢測,與其他二代測序技術相比,其試劑價格相對較高。ATGATTTTTGATTTTTTG焦磷酸測序BaseCalling

Roche454GenomeSequencerJonathanRothberg博士是454的創(chuàng)始人。2005年底，454公司推出GenomeSequencer20System(GS20)，開創(chuàng)了邊合成邊測序的先河。2008又推出了性能更優(yōu)GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)，使讀長、準確性進一步提升。核心技術：“DNA簇”—橋式PCR“可逆性末端終止子”

合成法測序原理：使用熒光標記的核苷酸以及可逆的終止子。在每一輪測序循環(huán)中,標記不同熒光基團的4種核苷酸以及DNA聚合酶同時加入流通池通道中,按照堿基互補配對的原則進行DNA鏈的延伸。每個核苷酸的3′羥基是被封閉起來,以防止額外的延伸。采集熒光圖像,堿基特異的熒光標記揭示了這一輪中新加入核苷酸是什么,也就獲得模板中這一位置的DNA序列。然后,打開3′端,繼續(xù)進行下一輪反應。這一過程重復多次,到50個循環(huán),產(chǎn)生50個堿基的DNA序列。~1000moleculesper~1μmcluster

~1000clustersper100μmsquare~40millionclustersperexperimentPrepareDNAfragmentsLigateadaptersAttachsinglemoleculestosurfaceAmplifytoformclusters20micronsSequence5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents Removeunincorporatedbases DetectsignalCycle2-n:Addsequencingreagentsandrepeat1、每輪測序反應加入四種帶有熒光標記的dNTP，末端帶有可以被去除的阻斷基團2、每輪反應只能整合一個核苷酸，儀器讀取相應的熒光信號3、信號讀取結束，用化學方法去除阻斷基團，進行下一輪測序反應123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

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A

C

G

A

T…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages根據(jù)每個點每輪反應讀取的熒光信號序列，轉換成相應的DNA序列Basecallingfromtherawdata優(yōu)點：可擴展的超高通量，需要樣品量少（低至100ng），運行成本較低，性價比高。成本低廉：每測量100萬個堿基對所需成本3美元；可精確讀取>18個的連續(xù)重復堿基如AAAAAAAAAAAAAAAAAA，TTTTTTT。缺點：其主要的缺點是由于光信號衰減和移相的原因使得序列讀長較短（熒光標記、封閉基團）。IlluminaGenomeAnalyzerIllumina公司于2007年促成GenomeAnalyzer的商品化。荷蘭科學家利用它首次繪出女性的基因組圖譜。此外第一個亞洲人圖譜，第一個癌癥病人圖譜和第一個非洲人圖譜全是依賴GenomeAnalyzer完成的。Illumina估計占有60%左右的測序市場

連接法測序

核心技術：熒光標記的8核苷酸探針雙堿基編碼策略原理： 與454情況相同也采用了微乳滴PCR與微球相結合的策略來擴增DNA模板。連接反應的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，按照堿基互補規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。SOLiD利用探針的連接反應讀取模板的DNA序列下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對和4種探針顏色的對應關系主要步驟：2·3·1文庫準備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測序模板:片段文庫(fragmentlibrary)或配對末端文庫(mate-pairedlibrary)。片段文庫就是將基因組DNA打斷,兩頭加上接頭,制成文庫。該文庫適用于轉錄組測序、RNA定量、miRNA研究、重測序、甲基化分析及ChIP測序等。配對末端文庫是將基因組DNA打斷后,與中間接頭連接,環(huán)化,然后用EcoP15酶切,使中間接頭兩端各有27bp的堿基,最后加上兩端的接頭,形成文庫。該文庫適用于全基因組測序、SNP分析、結構重排及拷貝數(shù)分析等。2·3·2擴增SOLiD用的是與454技術類似的乳液PCR對要測序的片段進行擴增。在微反應器中加入測序模板、PCR反應元件、微珠和引物,進行乳液PCR(emulsionPCR)。PCR反應結束后,磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同一DNA模板的擴增產(chǎn)物。2·3·3

微珠與玻片連接乳液PCR完成之后,變性模板,富集帶有延伸模板的微珠,微珠上的模板經(jīng)過3′修飾,可以與玻片共價結合。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納更高密度的微珠,在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量。含有DNA模板的磁珠共價結合在SOLiD玻片表面,SOLiD測序反應就在SOLiD玻片表面進行。每個磁珠經(jīng)SOLiD測序后得到一條序列。綠宇生物科技專業(yè)建庫測序QQ:110199525每個探針進行檢測的兩個堿基后面有三個匹配堿基，因此一條測序引物讀取的序列是不完整的測序引物與adapter退火探針連接，檢測熒光切除熒光基團第二輪探針連接，檢測熒光切除熒光基團測序引物沿著Adapter移動5次，確保每個位點都被檢測(二）

（三）0位置是Adapter的最后一個堿基，因此只檢測一次，該堿基是進行解碼所必須的。綠宇生物科技專業(yè)建庫測序QQ:110199525優(yōu)點：SOLiD系統(tǒng)原始堿基數(shù)據(jù)的準確度大于99.94%，是目前新一代基因分析技術中準確度最高的。就通量而言，SOLiD3系統(tǒng)是革命性的，超高通量是該系統(tǒng)最突出的特點，目前SOLiD3單次運行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當于17倍的人類基因組覆蓋度。缺點：該技術主要的缺點是序列讀長相對較短（30-35bp）.這也是由于同一簇擴增產(chǎn)物中存在移相造成的。（3）LifeTechnologiesSOLiDSystem2005年，在454推出了GS20焦磷酸測序平臺，ABI迅速收購了一家