LC3000現(xiàn)場培訓教程

一、色譜技術回顧色譜的起源(色譜法是什么？)色譜法最早出現(xiàn)，是俄國植物學家Tswett于1903年在波蘭華沙大學研究植物的葉子組成時，用碳酸鈣作為吸附劑，分離植物干燥葉子的石油醚萃取物；植物的色素吸附在管內的碳酸鈣里，再用純凈的石油醚洗脫被吸附的色素，于是管內的碳酸鈣上形成了三種顏色的6個色帶。當時，Tswett把這種色帶叫做“色譜”，其英文譯名為Chromatography。這一方法中的碳酸鈣成為“固定相”，而純凈的石油醚被稱為“流動相”。Tswett的方法就成為液固色譜（Liquid－SolidChromatography）。TewettM,BerDtschBotGes,1906;24:316.內容一、色譜技術回顧二、高效液相色譜法及色譜基本語言三、培訓設備四、溶劑準備五、LC3000色譜儀組成六、LC3000系統(tǒng)基本操作七、HPLC維護知識分離結果流動相固定相起源Tewett1903色譜技術回顧色譜技術回顧色譜法的原理圖形化解釋色譜法

100米短跑8位選手位于起跑線上開始：(樣品溶液在進樣閥))跑道阻力,空氣阻力：（色譜柱）肌肉動力:（輸液泵）拍照和終點線：(檢測器)秒表：（工作站)色譜分離的機理★★色譜分離是一個物理的過程流動相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）樣品（溶解于流動相中的溶質）色譜技術回顧色譜技術回顧色譜法是什么？色譜法是利用不同性質的物質在不相混溶的兩相中分配系數(shù)，吸附解吸附或其它性能不同而被分離。色譜技術回顧常規(guī)分類方法按流動相的物態(tài)分:–氣相色譜(GasChromatography,GC)用氣體作為流動相(又叫載氣)–液相色譜(LiquidChromatography,LC)用液體作為流動相(又叫洗脫劑)-超臨界流體色譜（是指使用條件，超過了流動相的臨界溫度和壓力，以CO2為代表）按固定相的形態(tài)分:–平面色譜紙色譜薄層色譜–柱色譜按流動相和固定相的相對極性分:–正相色譜(NormalPhaseChromatography)固定相的極性大于流動相–反相色譜(ReversedPhaseChromatography)固定相的極性小于流動相反相色譜最常用的流動相及其洗脫強度：水<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<異丙醇<四氫呋喃最常用的流動相組成“甲醇-水；乙腈-水”正相色譜最常用的流動相及其洗脫強度：正己烷<乙醚<乙酸乙酯<異丙醇**應用添加劑，成為離子對、離子抑制方法色譜技術回顧按分離過程的機理分:–吸附色譜(AbsorptionChromatography)根據樣品組分對活性固定相表面吸附親和力的不同實現(xiàn)分離–分配色譜(PartitionChromatography)分離基于樣品組分在固定相和流動相中的溶解度(分配系數(shù))不同–離子交換色譜(IonExchangeChromatography)根據樣品組份離子交換親和力的差異分離,簡稱離子色譜(IC)–體積排除色譜(SizeExclusionChromatography)GPC(GelPermeationChromatography)凝膠滲透色譜法–固定相是疏水性凝膠,流動相是有機溶劑GFC(GelFiltrationChromatography)凝膠過濾色譜法–固定相是親水性凝膠,流動相是水溶液什么是高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器……廣泛應用于各個領域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學/食品及農業(yè)……二、高效液相色譜與經典液相色譜（柱色譜）比較

高效液相色譜發(fā)展高效液相色譜分析定性定量

確定樣品中化合物制備提取分離純化混合物中有價值的化合物液相色譜儀的兩大主要用途高效液相色譜色譜圖：HPLC圖形結果（Chromatogram）←色譜峰保留時間（分）基線↓峰高峰寬響應值色譜圖液相色譜圖相關術語峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距離半（高）峰寬－PeakWidthatHalfHeight通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側相交兩點之間的距離峰面積－PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱響應值液相色譜圖相關術語基線－Baseline在正常操作條件下，僅由流動相所產生的響應信號的曲線基線飄移－BaselineDrift基線隨時間定向的緩慢變化基線噪聲－BaselineNoise由各種因素所引起的基線波動液相色譜圖相關術語死體積，V0－Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積保留體積，VR－Retentionvolume組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積死時間，t0－Deadtime不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間保留時間，tR－Retentiontime組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間柱效–色譜柱的分離效率理論塔板數(shù)–用于定量表示柱效，假設一根柱子可以分為N段，在每段內組分在兩相間很快達到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。設柱長為L，理論塔板高度為H，則H=L/N，式中N為理論塔板數(shù)。★★經驗計算公式：N=L/2d(d為填料的直徑)理論塔板數(shù)N與柱長有關，當比較兩不同長度的色譜柱的柱效時，應當比較它們在相同柱長下的N值。液相色譜相關術語液相色譜相關術語拖尾因子–Tailingfactor,Tf峰高5%處的峰寬與峰極大到前伸沿之間二倍距離之比

Tf=(A+B)/2A不對稱因子-Asymmetry,As

峰高10%處的前沿峰寬比后沿峰寬

As=A/B柱效測試參考方法條件（Φ100*250mm制備柱）：流速：150--250mL/min流動相：CH3OH（90%CH3OH-H2O）進樣體積：1-2mL檢測波長：254nm樣品名稱：苯、甲苯、萘、蒽樣品濃度：1mg/ml(1ml/100ml)環(huán)境溫度；柱壓；柱效；拖尾因子柱效圖譜分離度-簡單說來,分離度即是兩峰相對于其峰寬分開得有多遠液相色譜相關術語液相色譜方法開發(fā)液相色譜實驗所需的基本參數(shù)流動相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內徑、長短流動相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測器參數(shù)：紫外檢測波長，靈敏度等溫度控制進樣量以上參數(shù)即構成一個具體的HPLC方法；亦稱色譜條件線性色譜與非線性色譜比較線性色譜的特點有三：保留行為（時間，體積）只與樣品本身有關，與濃度無關。峰高或峰面積與濃度成比例，在線性范圍里色譜峰是高斯峰，對稱分布非線性色譜的特點也有三：一．色譜峰保留行為（時間，體積）不僅與樣品本身有關，還與濃度無關。二．峰高或峰面積與濃度不成比例。三．色譜峰是不對稱的三、培訓設備二、培訓設備CXTHLC3000色譜儀P3000高壓輸液泵UV3000紫外檢測器7725i手動進樣閥T2000柱溫箱（可選）C18色譜柱250×4.65u（可選）其它色譜基本條件（流動相準備、電腦和實驗臺等）四、溶劑準備1、條件：色譜級純或者優(yōu)級純甲醇或者乙腈（ACN）、二次蒸餾水2、流動相的過濾和超聲3、樣品的前處理和過濾五、LC3000色譜儀組成1、P3000泵一元（等度）系統(tǒng)兩元（梯度）系統(tǒng) P3000泵界面和基本操作泵內部結構工作原理簡介圖泵頭以及傳動結構圖泵頭以及傳動結構圖液相色譜泵主要耗材單向閥及內部結構單向閥單向閥內部結構基本操作泵的基本操作可以通過CXTH-3000工作站（推薦使用）或者泵儀器面板控制。以下是泵面板的基本控制按鈕PUMP/STOP

鍵：按一下該按鍵可以運行泵，再按一下停止泵運行。START/HOLD鍵：按一下該鍵運行預先設定的程序鏈（PROGRAM）。

再按一下保持此時的程序運行

PURGE鍵：沖洗鍵。按一次泵按照（SYSTEMSETING）系統(tǒng)設定中

設定沖洗流量運行沖洗。

再按一次泵停止沖洗。作用：沖

洗泵頭氣泡

和快速更換流動相。

DEL鍵：退出鍵或者刪除鍵。進入子菜單下通過此鍵退回上一菜單。ENTER鍵：進入鍵或者確認鍵。按該鍵進入子菜單。方向鍵：光標的上下左右移動。常見問題（泵的密封墊）泵的密封墊是最易損耗的部件，密封墊的損壞會引起系統(tǒng)的多種故障，滲漏和墊圈碎片會污染系統(tǒng)。密封墊磨損是不能避免的，一定的保養(yǎng)會延長其壽命。1每天使用完畢后將泵頭中的緩沖鹽置換掉。2使用色譜級流動相3貯液瓶中加裝入液管口過濾器4保持儀器在較低壓力下運行常見問題（單向閥）單向閥失靈：球與閥座密封不嚴，造成液流倒流壓力不穩(wěn)，或者球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴是污染或者氣泡引起的，球與閥座粘在一起是由于污染或者磨損造成的?？扇〕鰡蜗蜷y放入甲醇、乙腈、稀硝酸內超聲15min，再反復用甲醇、水沖洗數(shù)次。泵參數(shù)P3000A型高壓輸液泵流量范圍：分析型0.001-9.999mL/min半制備型0.01-49.99mL/min流量精確度：±0.5%(1mL/min)流量準確度：RSD≦0.1%(1mL/min)P6000制備型高壓輸液泵流量范圍：1-10