染料木黃酮對卵巢癌HO

染料木黃酮對卵巢癌HO【摘要】目的：觀察植物雌激素染料木黃酮與順鉑聯(lián)合應(yīng)用治療人卵巢癌裸鼠移植瘤的效應(yīng)及其機(jī)制.方法：建立20只人卵巢癌裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分成4組，分別為對照組、GEN組、DDP組及GEN+DDP組.4wk后處死裸鼠，計(jì)算抑瘤率，用Ⅷ因子抗原多克隆抗體測定腫瘤內(nèi)微血管密度，用細(xì)胞增殖指數(shù)反映細(xì)胞增殖狀態(tài)，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察.結(jié)果:DDP組及GEN組均可有效抑制卵巢癌移植瘤生長，二者聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用.GEN+DDP組MVD和PI低于GEN組和DDP組()，3組均顯著低于對照組().形態(tài)學(xué)觀察可見GEN組和GEN+DDP組細(xì)胞凋亡、凋亡小體及變性壞死增多，而對照組少見.結(jié)論：GEN對人卵巢癌HO8910PM細(xì)胞裸鼠移植瘤有明顯抑制作用，且與DDP有協(xié)同作用；GEN對腫瘤細(xì)胞的作用，與抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤區(qū)新生血管的生長、阻斷腫瘤血供有關(guān).

【關(guān)鍵詞】卵巢腫瘤；染料木黃酮；順鉑；新生血管化，病理性；增殖細(xì)胞核抗原

0引言

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首.重金屬化療藥順鉑是治療卵巢癌最有效的藥物之一，但因其毒副作用明顯，很多患者不能耐受，使其應(yīng)用受限.染料木黃酮是植物雌激素的一種，體內(nèi)外研究表明GEN對乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞有明顯抑制作用［1-3］.目前關(guān)于GEN對卵巢癌的體內(nèi)研究甚少.本研究以HO8910PM細(xì)胞株構(gòu)建人卵巢癌裸鼠移植瘤模型，觀察GEN及其與DDP的聯(lián)合應(yīng)用對卵巢癌的作用，并對其機(jī)制進(jìn)行評價，為GEN的開發(fā)和提高卵巢癌臨床治療療效提供新的思路.

1材料和方法

材料

人卵巢癌細(xì)胞株HO8910PM由第四軍醫(yī)大學(xué)婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室提供；Balb/c遺傳背景的先天性細(xì)胞免疫缺陷動物，nu/nu裸小鼠，雌性，鼠齡4～6wk，體質(zhì)量18～21g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司［許可證號：SCXK(滬)20030003］，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級環(huán)境［許可證號：SYXK(軍)2002023］.DDP為山東齊魯制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號0412149；GEN為第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所產(chǎn)品，批號:20041225；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體、小鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原單克隆抗體及SP免疫組化試劑盒，購自北京中杉金橋生物公司.

方法

動物模型的建立卵巢癌細(xì)胞株HO8910PM，常規(guī)方法復(fù)蘇，接種于含150mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃，50mL/LCO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，大量擴(kuò)增細(xì)胞.將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制成2×107/mL懸液，注入裸鼠后背部皮下.穿刺點(diǎn)距注射部位cm，每只裸鼠皮下接種1點(diǎn)，每點(diǎn)mL，含4×106個細(xì)胞.

治療待移植瘤直徑長成4mm左右時，采用隨機(jī)數(shù)字法將20只裸鼠隨機(jī)分成4組，每組5只.GEN組灌胃給予GEN50mg/kg?d，共30d；DDP組腹腔注射DDP5mg/kg?d，實(shí)驗(yàn)開始連續(xù)用1wk后停藥；GEN+DDP組給予GEN及DDP，給藥方法及途徑同上；對照組每日灌胃給予去離子水.每只裸鼠灌胃或腹腔注射劑量為mL/次.

觀察指標(biāo)GEN治療30d后，脫頸處死各組裸鼠，稱體質(zhì)量，解剖裸鼠.取移植瘤稱質(zhì)量，計(jì)算各組平均瘤質(zhì)量及抑瘤率，IR＝×100％.按金正均法計(jì)算q值來評價GEN與DDP兩藥合用的效果，q=(EA+B)/［EA+(1-EA)×EB］,EA+B為兩藥合用時的抑瘤率，EA和EB為各藥單獨(dú)應(yīng)用時的抑瘤率.q＜表示兩藥有拮抗作用，≤q≤表示兩藥有相加作用，q＞表示兩藥有協(xié)同作用.各組裸鼠心、肝、脾、肺、腎等重要臟器及移植瘤，用40g/L中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片.HE染色，光鏡下觀察.SP免疫組化按試劑盒說明進(jìn)行操作，Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體或PCNA抗體的工作濃度均為1∶100.Ⅷ因子只在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，任何一個胞質(zhì)呈棕染色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，與周圍其他組織有明顯界限，無論有無管腔，定義為一個血管.在低倍鏡下選定移植瘤內(nèi)血管密度最高的5個區(qū)域，再在高倍鏡(200倍)下計(jì)數(shù)每個視野的血管條數(shù)，以平均值為該移植瘤的微血管密度［4］.PCNA定位于細(xì)胞核上，陽性染色為棕黃色.先在低倍鏡下選擇染色陽性的高密度區(qū)域，再換高倍鏡(200倍)觀察，至少計(jì)數(shù)500個腫瘤細(xì)胞，其中陽性細(xì)胞所占百分比即為PCNA標(biāo)記指數(shù)(PCNAlabellingindex,PI).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，各組經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析以及兩兩比較的LSD法.為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2結(jié)果

對人卵巢癌裸鼠移植瘤生長的影響GEN組在用藥15d后移植瘤生長速度開始放緩，裸鼠正常進(jìn)食并且體質(zhì)量增加.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，GEN組移植瘤平均瘤質(zhì)量g，低于對照組g，DDP組移植瘤平均瘤質(zhì)量也低于對照組.GEN+DDP組移植瘤生長抑制最明顯，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)移植瘤生長緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，移植瘤平均瘤質(zhì)量明顯降低g，也低于DDP組和GEN組.GEN組、DDP組和GEN+DDP組抑瘤率分別為%,%和%，按金正均法計(jì)算q值為

裸鼠體質(zhì)量的變化實(shí)驗(yàn)開始各組裸鼠體質(zhì)量差異無顯著性.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，DDP組體質(zhì)量g均低于GEN組g和GEN+DDP組g；并且實(shí)驗(yàn)結(jié)束時DDP組體質(zhì)量也明顯降低g.與對照組體質(zhì)量g比較，GEN組體質(zhì)量和GEN+DDP組體質(zhì)量明顯增加.

移植瘤內(nèi)MVD和PI值GEN組，DDP組和GEN+DDP組移植瘤內(nèi)MVD值和PI值較對照組明顯降低，差異均有顯著性.表1人卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤組織MVD和PI值(略)

裸鼠重要臟器及移植瘤HE染色裸鼠重要臟器組織在光鏡下觀察未見明顯異常，各組無明顯差別.對照組腫瘤細(xì)胞排列成團(tuán)塊狀，細(xì)胞核大、濃染、不規(guī)則，核質(zhì)比例大，異染色質(zhì)成塊狀，邊極分布，核仁明顯，腫瘤細(xì)胞有少量壞死，可見較多核分裂象.GEN組腫瘤細(xì)胞排列成團(tuán)塊狀，腫瘤細(xì)胞部分區(qū)域壞死明顯，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，核仁不明顯，并可見凋亡細(xì)胞，核分裂象較少.DDP組腫瘤細(xì)胞可見壞死細(xì)胞較多.GEN+DDP組腫瘤細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)大片區(qū)域壞死，腫瘤細(xì)胞中有大量淋巴細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞體積變小，可見凋亡小體，細(xì)胞質(zhì)密度增大，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、碎裂成片狀，核分裂象少見.

3討論

染料木黃酮廣泛存在于植物中，為雜環(huán)多酚化合物，結(jié)構(gòu)為非類固醇類化合物，與17β雌二醇、己烯雌酚及三苯氧胺相似［5］.近年來大量體內(nèi)外研究表明GEN對乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，其機(jī)制可能為染料木黃酮增加DNA－拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)合物的穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂，從而引起腫瘤細(xì)胞生長抑制或死亡［6］.但目前關(guān)于GEN對卵巢癌作用的體內(nèi)研究相對較少.本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示GEN治療組抑瘤率可達(dá)%，表明人卵巢癌移植瘤的生長受到明顯抑制.成功阻斷腫瘤新生血管的形成，是抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［7］.本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建皮下移植瘤模型，應(yīng)用GEN干預(yù)治療，發(fā)現(xiàn)GEN組和GEN+DDP組腫瘤微血管數(shù)量減少，MVD值均顯著低于對照組，HE染色結(jié)果顯示GEN治療后移植瘤組織內(nèi)部分區(qū)域壞死明顯，提示GEN可通過抑制腫瘤血管生成導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死，發(fā)揮抗腫瘤作用.

PCNA是DNA聚合酶δ的輔助因子，是DNA合成不可缺少的因子，也是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白.許多研究證實(shí)，在生長快速的腫瘤組織中，增殖細(xì)胞均呈PCNA陽性反應(yīng)，因PCNA存在于增殖活躍的細(xì)胞核內(nèi)，故PCNA的表達(dá)可作為估計(jì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)［8］.本實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)GEN組和GEN+DDP組移植瘤生長緩慢，GEN+DDP組尤為明顯.GEN治療30d后GEN組和GEN+DDP組移植瘤質(zhì)量顯著小于對照組.通過對移植瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法檢測，發(fā)現(xiàn)GEN組和GEN+DDP組人卵巢癌細(xì)胞增殖核抗原表達(dá)下降，GEN組和GEN+DDP組PI值均顯著低于對照組.結(jié)果說明GEN還可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖，使腫瘤生長緩慢，表現(xiàn)其腫瘤抑制作用.

本實(shí)驗(yàn)中還選用陽性對照藥物DDP，來觀察GEN作用效能及藥物協(xié)同作用.DDP為婦科腫瘤治療中常用的化療藥物，尤其對卵巢癌有效［9］，但由于DDP只能靜脈或腹腔注射而不能口服給藥，加之胃腸道反應(yīng)明顯，骨髓抑制，腎臟、神經(jīng)毒性等毒副作用嚴(yán)重，使其臨床應(yīng)用受限［10］.本實(shí)驗(yàn)采用DDP腹腔注射途徑給藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時DDP組瘤質(zhì)量明顯低于對照組，但體質(zhì)量顯著低于實(shí)驗(yàn)開始時體質(zhì)量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明DDP可抑制卵巢癌裸鼠移植瘤生長，但其毒副作用仍不容忽視.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GEN+DDP組移植瘤生長緩慢，在各組裸鼠中GEN+DDP組抑瘤率最高.各組抑瘤率按金正均法計(jì)算q值大于，表明GEN和DDP有協(xié)同作用.更重要的是，GEN組和GEN+DDP組裸鼠體質(zhì)量較對照組明顯增加.GEN增加體質(zhì)量的作用，在臨床上可以緩解化學(xué)治療所致的厭食、體質(zhì)量減輕等癥狀，在細(xì)胞毒性化學(xué)治療中輔以GEN，可以增強(qiáng)癌癥患者對細(xì)胞毒性化學(xué)治療的耐受性.但GEN組和GEN+DDP組并沒有出現(xiàn)腫瘤消退現(xiàn)象，這可能與卵巢癌發(fā)病是多因素的有關(guān).

我們的研究提示GEN無明顯毒副作用，可有效抑制卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長，其機(jī)制與抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤血管生成相關(guān)，并且與DDP有協(xié)同效應(yīng).

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