釀酒酵母中的海藻糖合酶的基因重組

釀酒酵母中的海藻糖合酶（tps1）基因一、 背景知識：海藻糖合酶能夠?qū)Ⅺ溠刻寝D化為海藻糖，在海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的意義。海藻糖是由兩分子葡萄糖以1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，廣泛存在于細菌、酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲、無脊椎動物等生物體體內(nèi)。海藻糖對生物體具有非常重要的生物學意義，它是能源和碳源的儲備物，是蛋白質(zhì)和生物膜分子在脫水、高溫、氧自由基、低溫等惡劣環(huán)境中的穩(wěn)定劑和保護劑，是信號傳感復合物和生長調(diào)控因子,還是某些細菌細胞壁的組分之一。。由于海藻糖具有甜度適中，性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，無還原性等特殊性質(zhì)，以及其保護生物大分子（生物膜、蛋白質(zhì)、DNA）免受干燥、高溫、低溫、過氧等環(huán)境壓力破壞的獨特功能,因此該雙糖的應用價值十分巨大,已經(jīng)被廣泛應用于食品加工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、生化制品業(yè)和化妝品產(chǎn)業(yè)中。SaccharomycescerevisiaestrainP16trehalose-6-phosphatesynthase（TPS1）gene,completecdsGenBank:JF899168.11atgactacggataacgctaaggcgcaactgacctcgtcttcagggggtaacattattgtg61gtgtccaacaggcttcccgtgacaatcactaaaaacagcagtacgggacagtacgagtac121 gcaatgtcgt ccggagggct ggtcacggcg ttggaagggt tgaagaagac gtacactttc181 aagtggttcg gatggcctgg getagagatt cctgacgatg agaaggatea ggtgaggaag241 gacttgctgg aaaagtttaa tgccgtaccc atcttcctga gcgatgaaat cgcagactta301 cactacaacg ggttcagtaa ttetatteta tggccgttat tccattacca tcctggtgag361 atcaattteg acgagaatgc gtggttggca tacaacgagg caaaccagac gttcaccaac421 gagattgeta agactatgaa ccataaegat ttaatetggg tgcatgatta ccatttgatg481 ttggtteegg aaatgetgag agtcaagatt caegagaage aactgeaaaa egttaaggte541 gggtggttcc tgeacacace attcectteg agtgaaattt acagaatett acctgtcaga601 caagagattt tgaagggtgt tttgagttgt gatttagteg ggttceacac ataegattat661 gcaagacatt tettgtette egtgcaaaga gtgettaacg tgaacacatt geetaatggg721 gtggaatacc agggcagatt egttaacgta ggggccttee etateggtat egacgtggae781 aagttcaeeg atgggttgaa aaaggaatee gtacaaaaga gaatccaaca attgaaggaa841 aetttcaagg getgcaagat eatagttggt gtegacagge tggattacat caaaggtgtg901 cctcagaagt tgcaegecat ggaagtgttt etgaaegage atceagaatg gaggggcaag961 gttgttetgg tacaggttge agtgecaagt egtggagatg tggaagagta ceaatattta1021 agatetgtgg tcaatgagtt ggteggtaga atcaaeggte agtteggtae tgtggaatte1081 gtceccatee attteatgca caagtetata ccatttgaag agetgattte getatatgee1141 gtgagegatg tctgcttggt etegtceact egtgatggta tgaacttggt tteetaegaa1201 tatattgett gecaagaaga aaagaaaggt tccttaatcc tgagtgagtt cacaggtgee1261 gcacaateet tgaatggtge tattattgta aateettgga acacegatga tetttetgat1321 gecateaaeg aggeettgac tttgecegat gtaaagaaag aagttaactg ggaaaaactt1381 tacaaataea tetetaaata cacttetgee ttetggggtg aaaatttegt ccatgaatta1441 tacagtaeat eatcaagete aacaagetee tetgecacca aaaactga二、 目的基因酶切位點（如圖）SCAI08QampRlacZ'promoterpMB1oriSPHI(445：iHINDIII(4^i:+：HC1ItEianl^BsmAIBsaI*BcoDIpUC19EcoPlblBsaXITthllll*HhaIAcul*HinPlIPiel三、質(zhì)粒PUC19酶切位點（如圖）:+：Al：l：ItSall*BmgBISau96IEcoOioyiNSPIII(41可CYI(41可Xr-.ilAI(41.^1SMAI(415：iAMHI(41STI(41QiXBAI(424：iSALGIi：斗三口iACCI(43VjHINCII(432)INDII(432)PSTIi；44JZriBSPr-ilI(443jPAEIi：；445：i四、引物設計Forwardprimer:5'TGCACTGCAGATGAC3'Reverseprimer:5'CGGGATCCTCAGTTT3'酶切位點：BAMH1：GGATCC 保護堿基：CGLength：15bpLength：15bpPST1：CTGCAG保護堿基：TGCAGC=45%五、目的基因的獲?。篠upersciptII—RT合成第一鏈：在一RNase-free的0.2mlPCR管中，加入xulmRNA(大約500ng)1ulXhoIPrimer(1.4ug/ul)(5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')11-xulRNase-freewater(大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一鏈，第一鏈合成完畢后將n管合成一管進行第二鏈合成.)混勻后,70°C反應10分鐘；反應完成后，立刻將反應體系置于冰上5min;稍微離心一下，順序加入以下試劑：4ul5Xfirststrandbuffer2ul0.1MDTT1ul10mMdNTP(自己配制)5?混勻，稍微離心反應物之后,42C放置2分鐘；6?反應完成，趁熱加入1ulSupersciptII一RT,混勻；7.42C反應50分鐘，然后70C，15分鐘滅活反轉錄酶.cDNA第二鏈的合成：第一鏈反應完成后，取2ul一鏈產(chǎn)物一20C冰箱中保存，待電泳檢測。其余的產(chǎn)物合并,混勻，然后順序加入下列試劑(promega):20ul10XDNAPolymeraseIbuffer6ul10mMdNTP(自己配制)xulddH^)1ulRNaseH(2U/ul)10ulDNAPolymeraseI(10U/ul)總體系為200ul;混勻后，16°C反應2.5小時；70C滅活10分鐘；反應完成后，得到200ulcDNA第二鏈反應體系,將此體系置于冰上；取2ul二鏈產(chǎn)物，同保存的一鏈產(chǎn)物一起電泳鑒定。同時上1kbladder，確定雙鏈的大小范圍。注：一鏈，二鏈的電泳圖是smear,且二鏈稍比一鏈大一些。雙鏈cDNA末端補平：在第二鏈反應體系中，順序加入下列試劑(promega):6ul10mMdNTP2ulT4DNAPolymerase(8.7U/ul)2ulBSA(10mg/ml)稍微離心混勻反應物，37C反應至少30分鐘，然后75C滅活10分鐘；加入等體積酚/氯仿/異戊醇，劇烈振蕩后，常溫下13000g離心5分鐘；離心后，吸取上清于另一1.5mleppendof管中，加入等體積氯仿，上下顛倒幾次混勻后，常溫下13000g離心5分鐘；吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V3MNaAc(PH5.2)和2.5V預冷的無水乙醇，混勻，-20C放置過夜以沉淀雙鏈cDNA;第二日，將昨日沉淀物在4C,13000g離心60分鐘以充分沉淀雙鏈cDNA;離心完畢,棄上清，加入1ml70%乙醇洗滌沉淀，常溫下13000g離心5分鐘；&離心完畢,棄上清，干燥沉淀至無乙醇氣味.注：第3,第4步可以用PCR純化試劑盒代替。PCR純化試劑盒操作流程：溶液PE使用前應加入適量體積95%—100%的乙醇，混勻。向200ul二鏈補平產(chǎn)物中加入5倍體積的bufferPB,混勻。加入spincolumn中,13000rpm離心1min。加入0.75mlbufferPE,13000rpm離心1min。13000rpm,再離心1min。將spincolumn放入一新的離心管中，加入50ulbufferEB,靜置10min。13000rpm離心2min。加入30ulbufferEB,靜置10min。13000rpm離心2min。加入1/10體積3M的NaAc,2.5倍體積無水乙醇，混勻，一20°C沉淀過夜。4EcoRIadaptor加接：往雙鏈cDNA沉淀中加入9ulEcoRIadaptor(400ng/ul),4C至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀；溶解完成后,順序加入下列試劑：1.2ullOXLigaseBuffer1ul 10mMrATP1ul T4DNALigase(4U/ul)混勻后,4°C連接3days，或者8C過夜連接；5雙鏈cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:連接反應完成后，將反應體系70C放置15分鐘滅活T4DNALigase;稍微離心使反應物集中至管底，室溫下放置5分鐘,然后加入下列試劑：1ullOXLigaseBuffer1ul10mMrATP6ul ddH21ul T4PNK（10U/ul）37°C反應30分鐘，然后70°C滅活15分鐘；稍微離心使反應物集中至管底；室溫放置5分鐘;然后加入下列試劑：4ulXholOXBuffer2ulBSA5ulddH208ulXhoI（10U/ul）37C反應1.5小時，然后65C滅活酶10分鐘；反應完成，雙鏈cDNA合成完畢。置于4°C準備回收。膠回收cDNA（QIAEXIIGELExtractionKit回收試劑盒）配制小膠數(shù)板（每個樣品一板）：1%瓊脂糖凝膠，2ulEB/300ml膠取4°C保存樣品上樣，40ul/孔。電泳50V；1hr4?紫外燈下分別切下500~lkb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.，分別放入已做標記的1.5ml離心管中。稱取膠重，加入三倍體積bufferQXI（例如，100mg膠中加入300ulbufferQXI）50C水浴數(shù)分鐘，至膠完全融化。用手指彈QIAEXII使重懸，每管中加入5ulQIAEXII50C水浴10min，每隔2min取出顛倒混勻數(shù)次，使QIAEXII保持懸浮4C，13000rpm，30sec°（棄上清，離心機中甩一下，吸取上清）加入500ulbufferQXI，輕彈管底使QIAEXII重懸離心并去上清（同操作8）加入500ulbufferPE,重懸QIAEXII,離心30sec,去上清再加入500ulbufferPE,重懸QIAEXII,離心30sec,棄上清，離心機中甩一下，吸去上清超凈臺上吹干（至無乙醇味），加入10ulelutionbuffer，重懸QIAEXII，靜置5min,13000rpm,30sec。吸上清，冰上放置。取1ul上清上樣電泳，同時做分子量標準C1kbladder）及DNA含量標準（10ng,20ng）作對照。將收回的cDNA置于-20°C內(nèi)保存，據(jù)電泳結果，取適量DNA進行連接。六、通過PCR擴增目的基因：體系各成分用量(pl)lOXTaqbuffer2引物11引物21MgC】2(25mmolLt)24dNTP(2.5mmolL-i)1TemplateDNA1Taq酶(3U)1PCR反應擴增按如下程序進行:step194C5min預變性step294C1min變性step3XC1min復性step472Cymin延伸step5GOTOstep230循環(huán)step672C10min延伸step74C10min保溫step8End七、 PCR電泳檢測八、 構建表達載體（一）目的基因與質(zhì)粒連接兩種酶BAMH1、PST1切割BAMH11ul(1-2U)PST11ul(1-2U)目的基因5plPUC195plDNA連接酶1plbuffer2pl總量15pl體系（二）T載體與目的基因連接目的基因5pl T載體1plT4連接酶1pl緩沖液buffer3pl總量10pl體系九、轉化從甘油保存菌種中接種一環(huán)E.coli至LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。挑取2~3mm直徑的單菌落接種至有50mlLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37C震蕩培養(yǎng)2小時（搖床轉速250r/min）當0D590為0.375即可。吸取1.4ml菌液至Eppendorf管，7000g離心2min，棄上清，并倒置于吸水紙上。重復步驟3一次。將細菌懸浮于1ml預冷的0.1mol/lCaCl2溶液中，置冰浴10min。7000g離心2min，棄上清，收集細菌。將細菌重懸于200pl預冷的0.1mol/lCaCl2溶液，冰浴30min。&每管加入質(zhì)粒DNA50ng/10|jl，輕輕混勻，冰浴放置20min，設一不加質(zhì)粒DNA的對照。將管置于42C水浴中2min，不要搖動。迅速轉移至冰浴2min。加入800plLB液體培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)45min，以便轉化菌表達抗性。接種到含100pg/mlAmp的LB冷平板上。將平板倒置入37C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。確信對照無菌落時，在Amp培養(yǎng)基上長出的菌落即是轉化子。十、檢測（一）、藍白斑篩選是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如a-互補、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有B-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到B-半乳糖苷酶的氨基端而不