實驗四 食品中細菌菌落總數(shù)的測定

食品微生物學檢驗

菌落總數(shù)的測定

(GB

4789.2—2010)

一、

目的

1、

學習并掌握食品中菌落總數(shù)測定方法和原理。

2

、了解菌落總數(shù)測定在對被樣品進行衛(wèi)生學評價中的意義。二、原理

細菌數(shù)量的表示方法由于所采用的計數(shù)方法不同而有兩種：菌落總數(shù)和細菌總數(shù)。

1、菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1mL檢樣中形成的細菌菌落總數(shù)。以CFU/g（mL）來表示。一定條件包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、是否需要氧氣等。按國家標準方法規(guī)定，即在需氧情況下，36±1℃培養(yǎng)48±2h，能在平板計數(shù)瓊脂上生長發(fā)育的細菌菌落總數(shù)。所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。

菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，也不能區(qū)分其中細菌的種類，只包括一群在計數(shù)平板瓊脂中生長發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細菌菌落總數(shù)，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。

菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據(jù)。食品中細菌菌落總數(shù)越多，則食品含有致病菌的可能性越大，食品質(zhì)量越差；菌落總數(shù)越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合大腸菌群和致病菌的檢驗，才能對食品做出較全面的評價。

2、細菌總數(shù)指一定數(shù)量或面積的食品樣品．經(jīng)過適當?shù)奶幚砗?，在顯微鏡下對細菌進行直接計數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細菌總數(shù)也稱細菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1

g或1

mL樣品中的細菌總數(shù)來表示。三

、

材料

1、

食品檢樣

2、

培養(yǎng)基

平板計數(shù)培養(yǎng)基，無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液

3、

其它

無菌培養(yǎng)皿，無菌吸管，電爐、恒溫培養(yǎng)箱等。

四、

流程

1、檢樣2、做幾個適當倍數(shù)的稀釋液3、選擇2~3個適宜稀釋度各1

mL,分別加入滅菌平皿內(nèi)4、平皿內(nèi)傾注15～20

mL瓊脂培養(yǎng)基，混勻

5、36±1℃培養(yǎng)48±2小時或（24±2）小時6、記錄稀釋倍數(shù)和相應的各平板菌落數(shù)量7、計算菌落總數(shù)→報告五、

步驟

(一)

取樣、稀釋和培養(yǎng)

1、

以無菌操作取檢樣25g（mL），放于225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預置適量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振蕩或研磨制成1:10的均勻稀釋液。固體和半固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000～10000r/min的速度處理1～2min，制成1:10的均勻稀釋液。

2、用1

mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1

mL，沿管壁徐徐注入含有9

mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的試管內(nèi)，振搖試管或反復吹打混合均勻，制成1:100的稀釋液。

3

、另取1

mL滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1

mL吸管。

4、根據(jù)標準要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在制作10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。同時分別取1ml稀釋液（不含樣品）加入兩個滅菌平皿內(nèi)作空白對照。

5

、稀釋液移入平皿后，將冷卻至46℃瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15～20ml，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。

6、

待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，水產(chǎn)品30±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)72±3h。如樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4毫升），凝固后培養(yǎng)。

（二）

菌落記錄方法

做平板菌落數(shù)記錄時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于0～4℃，但不要超過24h。

1、

平皿菌落數(shù)的選擇

選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標準。每一個稀釋度應采用兩個平皿，大于300的可記為多不可計。

2、其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可以計算半個平板后乘以2，以代表一個平板的菌落數(shù)。

3、當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。

（三）菌落總數(shù)的計算

1、若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。

2、若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按如下公式計算：

N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1)

式中：

N―樣品中菌落數(shù)；

∑C―平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；

nl―第一個適宜稀釋度平板數(shù)；

n2―第二個適宜稀釋度平板數(shù)；

d―稀釋因子（第一稀釋度）。例如：

稀釋度

1:100（第一稀釋度）

1:1000（第二稀釋度）

菌落數(shù)

232，244

33，35

232+244+33+35(2+0.1×2)×10-2

=544/0.022=24727

四舍五入表示為:2.5×104

3、

若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均>300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

4、若所有稀釋度平板菌落數(shù)均<30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)計算。

5、若所有稀釋度平板均無菌落生長，則應按<1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。

6、若所有稀釋度均不在30～300之間，有的>300，有的又<30，則應以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。（四）

菌落計數(shù)報告方法

1、菌落數(shù)在1～100時，按四舍五入報告兩位有效數(shù)字。

2、菌落數(shù)≥100時，第三位數(shù)字按四舍五入計算，取前面兩位有效數(shù)字，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可以10的指數(shù)表示。

3、若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。

4、若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。

5、稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。注意事項

1、無菌操作

操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應當在超凈工作臺或經(jīng)過消毒處理的無菌室進行。

2、采樣的代表性如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。

3、稀釋液樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，或磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。

4、每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。

5、傾注用培養(yǎng)基應在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。

6、傾