雙向電泳技術(shù)和實(shí)驗(yàn)流程

1第三章雙向電泳技術(shù)和實(shí)驗(yàn)流程2*1809年俄國(guó)物理學(xué)家Peйce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。

*1909年Michaelis首次將膠體離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳。

他用不同pH的溶液在U形管中測(cè)定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動(dòng)和等電點(diǎn)。

*1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對(duì)電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開拓性貢獻(xiàn)而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

*1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過研究。

*從上世紀(jì)50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。

*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。

*由80年代發(fā)展起來的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。

*雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1000個(gè)E.coli蛋白。

3一、電泳的基本原理1、在電場(chǎng)作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis)。由F=Eq，f=6πrυ

η

可得υ=Eq/(6πrη)2、帶電顆粒的泳動(dòng)速度同電場(chǎng)強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷量成正比，與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比。蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。其泳動(dòng)速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量以及顆粒的大小和形狀。第一節(jié)蛋白質(zhì)電泳的基本原理4

在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷(種類和數(shù)量)、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。5二、影響電泳速度的因素

1、電場(chǎng)強(qiáng)度；2、緩沖溶液的pH；3、緩沖溶液的離子強(qiáng)度；4、電滲；5、焦耳熱三、電泳的分類

按原理分類：自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。穩(wěn)態(tài)電泳（或稱置換電泳）：分子顆粒的電泳遷移在一定時(shí)間達(dá)到一個(gè)穩(wěn)態(tài)后，帶的寬度不隨時(shí)間而變化。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對(duì)流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。67

按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。8③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測(cè)）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。9

另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：薄層電泳、板電泳、柱電泳。根據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量電泳、免疫電泳。按pH的連續(xù)性不同，可分為：連續(xù)pH電泳，不連續(xù)pH電泳。10四、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測(cè)定分子量、等電點(diǎn)等。111、丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：①幾乎無(wú)電滲作用。②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。?在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無(wú)色透明，有彈性，機(jī)械性能好，易觀察。?凝膠孔徑可調(diào)。?分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率。122、聚丙烯酰胺凝膠的聚合13催化劑和加速劑的種類①AP-TEMED：化學(xué)聚合作用。加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的堿基可使催化劑過硫酸銨(簡(jiǎn)稱AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活A(yù)cr單體，形成單體長(zhǎng)鏈，在交聯(lián)劑Bis作用下聚合成網(wǎng)狀的凝膠。②核黃素-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能發(fā)生，因?yàn)楹它S素在TEMED及光照條件下，還原成無(wú)色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。1415丙烯酰胺會(huì)產(chǎn)生如下幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)：?高濃度酸和堿會(huì)促進(jìn)其水解形成丙烯酸和NH3。?與一些羥基化合物如酚或酯族醇反應(yīng)，生成β-芳氧基或烷氧基丙酰胺。?在20℃能NH3反應(yīng)，生成β、β′、β″-氮川三丙酰胺。?與一些硫醇反應(yīng)，生成β-烷基丙酰胺。?也會(huì)由于超聲、γ-射線和自然光線引起聚合作用。如果烴鍵靠近在高度聚合的位置，酰胺基也會(huì)受到分子間的縮聚作用而成亞胺橋。16凝膠的孔徑可調(diào)性及其他性質(zhì)?每100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，用T%表示；

T%=(a+b)/m?a：丙烯酰胺克數(shù)；b：N,N-甲叉雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積(毫升)。3、聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑：1718濃縮效應(yīng)19聚丙烯酰胺凝膠電泳的異?，F(xiàn)象及解決辦法1.凝膠未聚合2.未加水層時(shí)凝膠聚合3.電泳后未能檢測(cè)出樣品4.樣品分離區(qū)帶寬或拖尾5.只顯一條區(qū)帶6.分離區(qū)帶呈條紋狀20第二節(jié)蛋白質(zhì)等電聚焦電泳1966年，瑞典科學(xué)家Rible和Vesterberg建立。等電聚焦：isoelectricfocusing,IEF。1.電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。蛋白進(jìn)入時(shí)，不同的蛋白移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白得以分離。2.優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測(cè)定蛋白或多肽的等電點(diǎn)。3.缺點(diǎn)：需無(wú)鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白。21

利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的（或非線性）pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。分析對(duì)象只限于蛋白質(zhì)和其他兩性分子。根據(jù)建立pH梯度原理不同，可分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度（carrierampholytepHgradient)和固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)。22一、基本原理1、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：取決于其氨基酸的組成。

組成每一種蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸的數(shù)目和比例是不同的，故蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)范圍很寬，這使得可以利用它來分離和分析蛋白質(zhì)。

232、聚焦效應(yīng)3、等電聚焦的分辨率24二、載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳1、載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的條件在等電點(diǎn)處有足夠的緩沖能力，以便能控制pH梯度，而不致被樣品的緩沖能力而改變pH梯度。在等電點(diǎn)處有足夠高的電導(dǎo)，以便使一定的電流通過，具備不同pH的載體有相同的電導(dǎo)系數(shù)，是整個(gè)體系中的電導(dǎo)均勻。分子質(zhì)量小，便于與被分離的高分子物質(zhì)分離?；瘜W(xué)組成不同于被分離物質(zhì)，不干擾測(cè)定。應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性。

由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備(有不同pH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體)252、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成有兩種方法產(chǎn)生pH梯度：用兩種不同的pH的緩沖液互相擴(kuò)散，在混合區(qū)形成pH梯度。這種方法形成的pH梯度很不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不使用。人工pH梯度。利用載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)作用下自然形成pH梯度，常用該方法。天然pH梯度。263、載體兩性電解質(zhì)分離原理等電聚焦樣品可放于任何位置。4、載體兩性電解質(zhì)的缺點(diǎn)載體兩性電解質(zhì)合成過程復(fù)雜，影響蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置，從而影響了重復(fù)性；負(fù)極漂移現(xiàn)象，使pH梯度不穩(wěn)定；負(fù)極漂移現(xiàn)象使堿性蛋白質(zhì)無(wú)法聚焦；凝膠灌制重復(fù)性差，凝膠機(jī)械穩(wěn)定性差，影響重復(fù)性。5、等電聚焦中應(yīng)注意的事項(xiàng)pH梯度的選擇；添加中性載體兩性電解質(zhì)；電流降到最小切恒定時(shí)盡快結(jié)束IEF;pH梯度測(cè)定：電泳結(jié)束后，用微電機(jī)檢測(cè)凝膠表面pH;蛋白質(zhì)在pI處形成沉淀。添加表面活性劑。27三、固相pH梯度等電聚焦電泳技術(shù)

固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù)。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。281、固相pH梯度的介質(zhì)

其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，它們與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有相似的聚合行為。292、固相pH梯度的建立

固相pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破要?dú)w功于Immobilines試劑（AmershamPharmaciaBiotech,APB）的基礎(chǔ)上開發(fā)的固相pH梯度（IPG）技術(shù)。Immobilines（固相試劑）是一系列性質(zhì)穩(wěn)定的具有弱酸弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類的聚合行為。每個(gè)分子都有一個(gè)單一的酸性或堿性緩沖基團(tuán)與丙烯酰胺單連，其結(jié)構(gòu)式為：

其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的雙鍵可以在聚合過程中共價(jià)鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質(zhì)中。所以它是固相的，即使是在電場(chǎng)中也不會(huì)漂移。分子另一端的R基團(tuán)為弱酸或弱堿性的緩沖基團(tuán)，利用緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段pH范圍就可形成近似線性的分布在pH3～10范圍的緩沖體系。所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時(shí)候便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場(chǎng)條件的改變而改變，后者是兩性分子，在電場(chǎng)中遷移到自己的等電點(diǎn)后才形成pH梯度。30固相pH梯度聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)結(jié)合緩沖基團(tuán)

314、固相pH梯度的優(yōu)點(diǎn)和注意事項(xiàng)3、固相pH梯度等電聚焦原理

蛋白質(zhì)分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中遷移，知道達(dá)到自己的等電點(diǎn)，停止遷移。

固相pH梯度可窄至pH0.1的范圍，因此分辨率極高，可達(dá)0.001pH；pH梯度穩(wěn)定，不漂移；靈活性大，可隨意選擇pH梯度和斜率；重復(fù)性好；加樣容量大；樣品中鹽的干擾??；對(duì)堿性蛋白質(zhì)也能很好的分離，無(wú)邊緣效應(yīng)，故可用很窄的膠條（如5mm寬）聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相，但固相pH梯度灌膠技術(shù)復(fù)雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠，電泳時(shí)候需要高電壓，電泳時(shí)間長(zhǎng)，窄范圍pH測(cè)定困難，只能計(jì)算。注意事項(xiàng)：溫度：20-30℃

；電壓：梯度上升。32加樣方式

33等電聚焦電泳進(jìn)行過程中等電聚焦電泳結(jié)束后（－）（－）高pH高pH低pH低pH34第三節(jié)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳一、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳1、基本原理:天然狀態(tài)生物大分子聚丙烯酰