外源基因表達(dá)調(diào)控1

第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控引言表達(dá)調(diào)控的研究?jī)?nèi)容起始密碼邊周序列（initialcode）翻譯增強(qiáng)因子（Ω

）密碼劑量效應(yīng)(codonbias)

啟動(dòng)子活性（promoter）增強(qiáng)子（enhancer）Poly(A)信號(hào)(signal)內(nèi)含子（intron）不穩(wěn)定因子隱含內(nèi)含子序列隱含Poly(A)信號(hào)外源基因在不同水平上的表達(dá)調(diào)控整合狀態(tài)基因活性調(diào)控水平DNA水平RNA水平蛋白質(zhì)水平轉(zhuǎn)錄效率轉(zhuǎn)錄加工mRNA穩(wěn)定性翻譯效率翻譯后修飾蛋白質(zhì)運(yùn)輸整合位置效應(yīng)（positioneffect）拷貝數(shù)影響（copiesnumbers）DNA再分布（DNArearrange）DNA甲基化（DNAmethylation）共抑制和反式失活（cosuppression&trans-inactivity）剪切內(nèi)含子-1葉綠體線粒體核糖基化信號(hào)肽第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控一.轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)1.瞬時(shí)表達(dá)

概念過(guò)程2.瞬時(shí)表達(dá)的機(jī)理

a.瞬時(shí)表達(dá)是沒(méi)有整合的外源基因的表達(dá)

b.瞬時(shí)表達(dá)是一種正常的表達(dá)方式3.外源基因瞬時(shí)表達(dá)的影響因素 （1）質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu) （2）內(nèi)源核酸酶的影響 （3）受體細(xì)胞生理狀態(tài) (4)內(nèi)源GUS酶抑制劑4.外源基因瞬時(shí)表達(dá)的應(yīng)用 （1）在基因轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用

a.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的檢測(cè)

b.優(yōu)化基因轉(zhuǎn)化條件 （2）植物基因表達(dá)調(diào)控的研究5.外源基因的穩(wěn)定表達(dá) 外源基因在植物細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)的條件

a.時(shí)間長(zhǎng) b.無(wú)迅速衰退現(xiàn)象

c.分子雜交證明DNA已經(jīng)整合到植物基因組中

d.能遺傳，并符合分離規(guī)律第三部分外源基因在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控一.轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)二.轉(zhuǎn)化外源基因的同源性和異源性表達(dá)異源性表達(dá)（heterologousexpression)同源性表達(dá)（homologousexpression)

異源性表達(dá)只是基因編碼序列“異源”，而啟動(dòng)子和其它調(diào)控序列必須與植物同源二.轉(zhuǎn)化外源基因的同源性和異源性表達(dá)1.真核生物基因在植物細(xì)胞中的表達(dá) 動(dòng)物基因在植物細(xì)胞中不表達(dá)的原因a.啟動(dòng)子不能被植物細(xì)胞識(shí)別，不能起始轉(zhuǎn)錄（hsp70例外）b.內(nèi)含子序列不同，hnRNA的加工修飾受阻。（雖然內(nèi)含子邊界相同GT/AG，但長(zhǎng)度和AT含量不同，植物較短100-200bp,而且AT含量高，因此植物細(xì)胞不能切除動(dòng)物內(nèi)含子）c.動(dòng)物細(xì)胞PolyA信號(hào)與植物不同，因此不能有效地識(shí)別d.動(dòng)、植物的翻譯系統(tǒng)的起始序列不同。動(dòng)物是CACCAUG

植物是AACAAUGGC 所以，當(dāng)用動(dòng)物基因轉(zhuǎn)化植物時(shí)要考慮這些差異，構(gòu)建載體質(zhì)粒時(shí)應(yīng)采用植物的調(diào)控序列.二.轉(zhuǎn)化外源基因的同源性和異源性表達(dá)2.原核生物基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)

原核與真核基因在表達(dá)機(jī)制上有很大的差異，因此細(xì)菌的基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞是不能表達(dá)的。即使采用了植物基因的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，沒(méi)有改造的細(xì)菌基因也只能很低水平的表達(dá)。例：Bt.δ-毒蛋白抗蟲(chóng)基因表達(dá)量?jī)H占植物可溶蛋白總量的0.001%達(dá)不到抗蟲(chóng)的目的。原因是，mRNA結(jié)構(gòu)中可能隱含有polyA信號(hào)AAUAA序列及內(nèi)含子切割序列等，從而造成mRNA在不適當(dāng)?shù)奈恢蒙蠑嗔讯到狻Ｏ蛑参镏幸隑t基因的改造。在不改變氨基酸序列的情況下，改變了20%的堿基序列，提高了GC含量，使其在植物中的表達(dá)由原來(lái)的0.001%提高到0.05~0.1%（提高了50-100倍）。抗蟲(chóng)效果明顯提高。向植物中引入Bt基因的改造修飾原則：1.優(yōu)先使用植物偏愛(ài)的密碼子2.改變基因的GC含量（36~45%），使之與植物基因GC含量一致3.注意XCG/XCC和XTA/XTT的比值。對(duì)植物而言，該比值低好。Thr,Pro,Ala和Ser密碼子第三位避免用G。4.翻譯起始區(qū)第4個(gè)核苷酸用G，以符合ATGGC的要求。5.去除隱含的poly（A）信號(hào)。如：AATAA，AATGAA，AATAAT，AATATT，GATAAA，GATAAG6.去除隱含的RNA聚合酶II終止序列。CAN1~9AGTNNAA7.清除發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。CUUCGG8.消除隱含的內(nèi)含子剪切序列。AAG.GTAAGT等

三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響1.高等植物基因的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(圖)10三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響1.高等植物基因的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)2.5’-端表達(dá)調(diào)控序列的基本特征

啟動(dòng)子Promoter

增強(qiáng)子Enhancer

沉默子Silencer

順式作用元件Cis-acting-element

反式作用因子Trans-acting-factor 啟動(dòng)子 確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列

TATAbox–25~-35負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的精確性 CAATbox GCbox–80~-110控制轉(zhuǎn)錄起始頻率

多數(shù)組成型啟動(dòng)子上游有（hexamermotif)TGACTG

可誘導(dǎo)啟動(dòng)子中常有CCACGTGG8核苷酸G-box植物轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處的保守序列:YYYAYYA+1三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子

增強(qiáng)子的作用是增強(qiáng)RNA的轉(zhuǎn)錄效率，其功能是通過(guò)結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子或影響DNA的構(gòu)象而實(shí)現(xiàn)的。增強(qiáng)子作用的三個(gè)特點(diǎn)： 1.它與啟動(dòng)子的相對(duì)位置和取向無(wú)關(guān)，具有遠(yuǎn)程效應(yīng) 2.需要特定的蛋白質(zhì)因子的參與 3.有些（如SV40的增強(qiáng)子)能在幾乎所有類(lèi)型細(xì)胞中發(fā)揮 作用，而大多數(shù)具有相對(duì)的組織特異性目前已分離的大量的啟動(dòng)子（包括增強(qiáng)子）按其作用方式大體可劃分為三類(lèi)組成型 誘導(dǎo)型 組織特異型三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子（1）組成型啟動(dòng)子

A.CaMV35S啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)子二.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子（1）組成型啟動(dòng)子

A.CaMV35S啟動(dòng)子

B.NOS啟動(dòng)子組成型,損傷,激素誘導(dǎo)活性,-123--114之間或重疊區(qū)有20ntZ-DNA形成因子可以與bZIP蛋白因子相互作用,誘導(dǎo)活性必需序列.啟動(dòng)子的強(qiáng)度依組織部位及器官位置而變化,老組織中強(qiáng),生殖器官中隨發(fā)育狀態(tài)而不同.在禾本科植物中完全或幾乎無(wú)啟動(dòng)子表達(dá)能力.

TGACGTAAGCACATACGTCA-123~114Z-DNA三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3.啟動(dòng)