人促黃體生成素光激化學發(fā)光免疫分析

人促黃體生成素光激化學發(fā)光免疫分析

人體激素（hlh）是對垂體前葉嗜堿性細胞的激素。這是一種白色糖蛋白，相對分子量為3000左右。hLH分子由兩條非共價連接的不同肽鏈(α和β)組成,α鏈與人促甲狀腺激素(hTSH)、人促卵泡激素(hFSH)及人絨毛膜促性腺激素(hCG)相似,但β鏈的氨基酸順序和組成不同,使其具有特異性,決定hLH的生物活性。在有卵泡刺激素存在下,與其協(xié)同作用,刺激卵巢雌激素分泌,使卵泡成熟與排卵,使破裂卵泡形成黃體并分泌雌激素和孕激素;對于男性主要是促進睪丸間質(zhì)細胞增生,促進睪酮的合成與分泌。在健康月經(jīng)周期女性中,hLH濃度變化受排卵周期的影響,因此測定血清中hLH濃度可以預測女性排卵狀況。此外,hLH的濃度變化和體內(nèi)很多疾病的發(fā)生也有直接的聯(lián)系,定量檢測出血清中hLH的濃度對臨床疾病的診斷有重要意義。目前廣泛應(yīng)用于臨床的是傳統(tǒng)的非均相免疫分析(如ELISA、時間分辨熒光免疫分析),需要通過洗滌來分離結(jié)合標記與游離標記,存在操作過程步驟多,不易標準化及自動化等缺點。本研究采用光激化學發(fā)光免疫分析(AlphaLISA)技術(shù)研制hLH定量檢測試劑,評價各項性能指標,并與其它檢測試劑盒進行比較,評價其在臨床檢測應(yīng)用中的可行性。1材料和方法1.1生物素和試劑2株配對hLH單克隆抗體為芬蘭Medix公司產(chǎn)品;hLH抗原購自美國Biodesign公司;生物素購自Sigma公司;受體微球、鏈霉親和素化的供體微球為美國PerkinElmer公司產(chǎn)品;96孔微孔板為美國PerkinElmer公司產(chǎn)品;檢測儀為美國PerkinElmer公司的2300EnSpireTM檢測儀。158份血清樣本來自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院。1.2實驗方法1.2.1稀釋液的制備稀釋hLH抗原至濃度分別為0、0.55、2.2、11、66、135U/L系列濃度,稀釋液為含50mmol/LTris-HCl,1.5%BSA、0.9%NaCl、0.05%NaN3、0.01%Tween-20,pH7.8的反應(yīng)緩沖液。1.2.2體外抗體反應(yīng)時間的合成將0.2mghLH抗體加入Millipore公司的帶有濾膜的離心管中,以9000r/min離心8min,用緩沖液(pH6.2、0.05mol/LMES溶液)重復洗滌6次后收集抗體,在抗體溶液中加入1mg受體微球、10μl25mg/mlNaBH3CN(用緩沖液配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)、1.25μl10%Tween-20,而后用緩沖液將體積補充到200μl,37℃避光振蕩反應(yīng)48h。最后加入10μl65mg/mlCMO(用0.8mol/LNaOH配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)37℃避光孵育1h封閉未結(jié)合位點,離心洗滌,得到已連接抗體的受體微球,調(diào)整受體微球濃度為5mg/ml。1.2.3抗體溶液的配制將0.5mg抗體加入到Millipore公司帶有濾膜的離心管中,以9000r/min離心8min,每次用200μl緩沖液(0.1mol/LNa2CO3/NaHCO3,pH9.5),重復洗滌6次后收集抗體,調(diào)整抗體濃度為20mg/ml。在抗體溶液中加入2μl22mg/ml生物素(用DMSO配制,現(xiàn)配現(xiàn)用),室溫振動孵育4h。利用PBS(pH7.4)4℃透析24h,每6h換液1次,收集透析袋中液體,并將其抗體濃度調(diào)整為0.5mg/ml。1.2.4檢測信號值的測定將25μl標準品或待檢測樣品加入微孔板中,并分別加入以分析緩沖液1∶50比例稀釋的已連接抗體的受體微球25μl、1∶100比例稀釋的生物素化抗體25μl,37℃振動孵育15min,然后在避光條件下加入鏈霉親和素化的供體微球175μl,37℃振動孵育15min后在2300EnSpireTM檢測儀上檢測信號值。1.3統(tǒng)計處理2結(jié)果2.1hlh試劑盒劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)以自制試劑中參考標準品濃度的對數(shù)為橫坐標,信號值計數(shù)的對數(shù)為縱坐標,由雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理,測得hLH試劑盒劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)為r=0.998(圖1),表明自制試劑有良好的劑量反應(yīng)。2.2標準曲線方程的分析靈敏度以零參考標準品測定值(n=20)的均值加上2倍的標準差后得到信號值,將其代入標準曲線方程計算所得為分析靈敏度,其值為0.164U/L。2.3研究對象含200U/LhFSH、324mU/LhTSH和2000U/LhCG標本在本試劑的測定值分別為1.05、1.24和3.45U/L。2.4試驗區(qū)域自制hLH光激化學發(fā)光免疫檢測試劑劑量-反應(yīng)曲線的范圍為0.164～135U/L。2.5價格精度以hLH國家標準品為對照品,自制試劑檢測國家標準品的偏差值均在0.900～1.100之間(表1),準確度良好。2.6測定條件60u/l采用自制的低、中、高3個hLH質(zhì)控品(質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,預期濃度分別為5、20、60U/L)進行測定。由表2可見,自制試劑的分析內(nèi)(同一實驗內(nèi)同一樣本重復測定)和分析間(同一試劑,不同批次之間)變異系數(shù)分別為4.3%～6.1%和7.4%～8.1%,符合體外診斷試劑檢定結(jié)果的變異系數(shù)(CV%)應(yīng)不高于10.0%的要求。2.7血清回收率及基質(zhì)物干擾試驗向5個已知濃度的hLH血清樣本中添加不同濃度的hLH純抗原,使得血清中hLH的最終期望濃度為100U/L,計算回收率,hLH的回收率在93.7%～105.9%之間,表明添加物與血清待測物一致,基本沒有血清基質(zhì)物的干擾(表3)。2.8光激化學發(fā)光免疫分析試劑反應(yīng)變化的檢測向已知濃度的血清樣本中分別添加血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素干擾物,比較測定濃度值和原始濃度值,結(jié)果表明自制hLH光激化學發(fā)光免疫分析試劑在檢測標本時基本不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾(表4)。2.9陽性符合率和陰性符合率陰、陽性血清標本各50份,分別用自制hLH光激化學發(fā)光免疫分析試劑(AlphaLISA)和羅氏電化學發(fā)光(ECLIA)診斷試劑盒進行測定,結(jié)果顯示,兩種診斷試劑的陽性符合率和陰性符合率均為100%。158份臨床血樣同時用自制試劑與ECLIA進行平行檢測,對所測數(shù)值進行配對t檢驗分析,結(jié)果顯示兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.468,P=0.07)。通過比較常用方法的檢測性能(表5),可以看出自制光激化學發(fā)光免疫分析試劑在檢測性能指標上與電化學發(fā)光免疫分析試劑盒、時間分辨熒光免疫分析試劑盒無明顯差異。3光激化學發(fā)光免疫分析法hLH作為一種內(nèi)分泌激素,它在血清中的含量變化反應(yīng)了體內(nèi)很多生理和病理狀態(tài)。其中hLH升高常見于多囊卵巢綜合征、先天性卵巢發(fā)育不全、先天性睪丸發(fā)育不良(不孕)、Turner綜合征、卵巢功能早衰及卵巢切除后。hLH降低則常見于腺垂體功能下降、黃體功能不全、長期服用避孕藥等,不孕癥患者血清hLH濃度極低。因此準確測定血清中hLH含量可以作為檢測疾病的根據(jù)以及進行療效跟蹤。另外hLH還可用于確定排卵時間、絕經(jīng)期、監(jiān)控內(nèi)分泌治療等。目前臨床檢測方法有放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、時間分辨(TRFIA)熒光免疫法和化學發(fā)光免疫法(CLIA)。但它們都有各自的缺點,RIA有放射性污染,且半衰期和試劑有效期短;ELISA只能定性,靈敏度低及線性范圍窄;CLIA不可反復測量,本底高,易受外界溫度,pH值的影響;TRFIA操作繁瑣,需要不斷的分離和洗滌。光激化學發(fā)光免疫分析法是一種通過化學發(fā)光檢測微球間的結(jié)合,進而檢測分析物含量的方法。在680nm的光照下,供體微球中的光敏物質(zhì)受到激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧,單線態(tài)氧擴散至受體微球,與其中的發(fā)光物質(zhì)反應(yīng)后產(chǎn)生615nm的化學發(fā)光。由于單線態(tài)氧在溶液中維持活性的時間很短(約4μs),只能擴散約200nm的距離,因此只有那些通過待測物質(zhì)連接在一起的受體微球和供體微球才能產(chǎn)生化學發(fā)光。該技術(shù)實現(xiàn)了均相免疫測定,避免了以往非均相檢測方法中的分離和洗滌過程,操作過程簡便,易實現(xiàn)自動化及規(guī)?；瘷z測,操作時間也短,可在35min完成,且整個操作過程不易受pH值、溫度等外界因素的干擾,保證了檢測的穩(wěn)定性和可重復性。此外,還具有靈敏度高、線性范圍寬、特異性強、時間分辨能力強、上樣量少(低至5μl)、價格低等優(yōu)點。該技術(shù)運用廣泛,已涵蓋蛋白質(zhì)、多肽激素、酶活性、核苷酸等眾多領(lǐng)域。本文旨在應(yīng)用光激化學發(fā)光免疫分析法來定量檢測人血清中hLH的含量,對于參考標準品的標定,與國家標準品的比值均在范圍之內(nèi)(0.9～1.1),說明檢測標本的濃度值是可信的。實驗結(jié)果顯示,其分析靈敏度為0.164U/L,較現(xiàn)有的一些檢測分析方法靈敏度皆高,這樣有利于提高檢出率,縮短窗口期。線性范圍為0.164～135U/L,最高檢出量有點偏低,但是血清中hLH濃度值大于135U/L的病例很少,為此不影響臨床實際運用。精密度實驗顯示,自制試劑分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)均低于10%,表明該系統(tǒng)的精密度較高。特異性結(jié)果顯示,與hTSH、hFSH和hCG無明顯交叉反應(yīng),可見采用的兩株單克隆抗體特異性好。158份臨床血清樣本用本試劑與羅氏電化學發(fā)光檢測試劑盒平行檢測,對所測數(shù)值采用配對t檢驗分析,結(jié)果顯