lc-msms法同時(shí)測(cè)定小鼠血漿中的cn486、蘆丁和曲克蘆丁

lc-msms法同時(shí)測(cè)定小鼠血漿中的cn486、蘆丁和曲克蘆丁

黃酮是植物中的一種多酚類化合物，通常以糖的形式連接到一些物質(zhì)。黃酮類化合物抗氧化、促進(jìn)血液循環(huán)、抗病毒等方面的活性已久為人知,被認(rèn)為是低毒并有保健功能的一類天然化合物。但由于黃酮苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜、代謝廣泛給其藥代動(dòng)力學(xué)研究帶來(lái)很大難度,甚至成為制約其藥用開(kāi)發(fā)的瓶頸。在學(xué)術(shù)界有關(guān)黃酮苷的體內(nèi)吸收問(wèn)題多年來(lái)也一直是爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。黃酮類化合物從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看有如下特點(diǎn):以槲皮素為基本骨架的黃酮所占比例最多,而槲皮素多被糖基化且糖基化的位置多發(fā)生于3位的羥基,75%的黃酮醇苷在3位都含有糖鏈。因此,開(kāi)展槲皮素-3-O-黃酮苷的研究對(duì)于黃酮類化合物研究具有很好的典范作用。槲皮素-3-O-芹菜糖-(1→2)-鼠李糖-(1→6)-葡萄糖苷,代號(hào)CTN986,是從無(wú)毒棉花籽中分離得到具有抗抑郁活性的槲皮素-3-O-黃酮三糖苷。蘆丁(rutin)是CTN986脫去一分子芹菜糖后的槲皮素-3-O-黃酮二糖苷,具有維持血管彈性、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、降低血管脆性和通透性的作用,常用于防治高血壓病的輔助治療。曲克蘆丁(troxerutin)是為改善蘆丁的生物利用度而將蘆丁羥乙基化制成的半合成黃酮類化合物,是商品藥維腦路通的主要成分,具有抑制血小板聚集,防止血栓形成,同時(shí)增加血中氧飽和度,改善微循環(huán)的作用。目前,分別測(cè)定血漿中CTN986、蘆丁和曲克蘆丁的分析方法已有文獻(xiàn)報(bào)道,但同時(shí)測(cè)定三者的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定小鼠血漿中三者濃度的LC-MS/MS法,并應(yīng)用此法比較了小鼠口服和靜注上述3個(gè)化合物后的藥動(dòng)學(xué)特征,以及P-gp抑制劑維拉帕米對(duì)三者在小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為的影響。1材料和方法1.1儀器和色譜條件CTN986和CTN987(內(nèi)標(biāo))由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所植物化學(xué)研究室提供,蘆丁購(gòu)自AcrosOrganics公司,曲克蘆丁購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司,異丙醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)J.T.Baker公司。API3000型串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有TurboIonspray離子化源以及Analyst1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),美國(guó)ABSciex公司);Agilent1100四元梯度泵和自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Agilent公司);固相萃取儀(美國(guó)Supelco公司);BakerbondC18固相萃取柱(100mg,1ml,美國(guó)J.T.Baker公司)。1.2甲醇-異丙醇-水-甲醇c分析柱為DiscoveryC18柱(250mm×4.6mm,5μm),C18保護(hù)柱(4.0mm×3.0mm,I.D.),流動(dòng)相為甲醇-異丙醇-水-甲酸(體積比為36∶8∶56∶0.1),流速0.5ml/min,進(jìn)樣量20μl,柱溫25℃。1.3ctn986掃描方法離子源為ESI源;正離子模式檢測(cè);噴射電壓為4500V;源溫度為300℃;霧化氣為6;卷簾氣為10;碰撞氣為6;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè),用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z743→m/z303(CTN986)、m/z611→m/z303(蘆丁)、m/z743→m/z435(曲克蘆丁)、m/z727→m/z287(內(nèi)標(biāo)CTN987),掃描時(shí)間為150ms。相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖如圖2所示。1.4tn987-u3000試劑取血漿100μl,置1.5ml塑料離心管中,加水60μl(補(bǔ)足和標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的體積),再分別加入內(nèi)標(biāo)溶液(500ng/mlCTN987水溶液)20μl、水200μl、酸化試劑(0.25mol/LH3PO4)100μ1,渦流3min,離心10min(16000×g)。取全部上清液置已經(jīng)活化好的SPEC18柱上,先用2×1ml去離子水沖洗,再用2×1ml甲醇洗脫。收集甲醇洗脫液,于50℃下以空氣流揮干,殘余物用150μl甲醇-水-甲酸(體積比為30∶70∶0.1)復(fù)溶,取20μl進(jìn)行LC-MS/MS分析。1.5ctn986/蘆丁/曲克蘆丁單次給藥的安全性ICR雄性小鼠243只,體質(zhì)量約20～25g,隨機(jī)分成維拉帕米預(yù)處理、非處理組和靜脈注射3大組,每組81只;每大組再隨機(jī)分為CTN986、蘆丁和曲克蘆丁組,每組27只。預(yù)處理組先灌胃給予5mg/kg的維拉帕米,連續(xù)3d,2次/d,期間不斷食。預(yù)處理組和非處理組于第3天末禁食12h后,分別灌胃給予CTN986(200mg/kg)、蘆丁和曲克蘆丁(100mg/kg)。靜脈注射組分別尾靜脈注射CTN986、蘆丁和曲克蘆丁(給藥劑量均為10mg/kg)。灌胃給藥組于給藥前和給藥后0.08,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0和12.0h眼眶采血0.5ml,靜脈注射組于給藥前和給藥后0.03,0.08,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,和8.0h眼眶采血0.5ml,離心10min(6000×g),分離出血漿,于-20℃冷凍保存待測(cè)。1.5數(shù)據(jù)處理和分析應(yīng)用Winnolin藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,獲得相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。2結(jié)果2.1克氏原螯蝦葉片分子m/z303和曲克蘆丁的主要碎片采用ESI源,在正離子檢測(cè)方式下,獲得了CTN986、蘆丁和曲克蘆丁的一級(jí)全掃描質(zhì)譜,主要生成[M+H]+峰。繼續(xù)對(duì)基峰離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,CTN986和蘆丁的主要碎片均為脫糖后的苷元離子m/z303,曲克蘆丁的主要碎片為脫糖后的離子m/z435。選取在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式下,對(duì)待測(cè)物的各質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。另外,由于CTN986的[M+H]+離子(m/z743)在離子源內(nèi)能夠發(fā)生源內(nèi)裂解,產(chǎn)生失去一個(gè)糖的碎片離子m/z611,而這個(gè)碎片離子又與蘆丁的[M+H]+離子相一致,并且都能在二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生苷元離子m/z303,從而干擾蘆丁的測(cè)定,為了避免這種因源內(nèi)裂解而產(chǎn)生的干擾,必須使CTN986和蘆丁實(shí)現(xiàn)完全的色譜分離。2.2色譜柱的選擇應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行定量分析時(shí),選用短的色譜柱可以縮短保留時(shí)間,提高分析速度。但在此實(shí)驗(yàn)中,使用短柱很難實(shí)現(xiàn)CTN986和蘆丁的基線分離,并且存在明顯的基質(zhì)抑制現(xiàn)象,最后我們選擇了250mm×4.6mm的DiscoveryC18色譜柱。另外,為了改善色譜分離、提高質(zhì)譜響應(yīng),我們對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)甲醇比乙腈更有利于待測(cè)物的離子化,低濃度甲酸可改善色譜峰拖尾,異丙醇則能顯著提高待測(cè)物的質(zhì)譜響應(yīng),最終我們選用甲醇-異丙醇-水-甲酸(體積比為36∶8∶56∶0.1)作為流動(dòng)相,獲得較好的峰形和質(zhì)譜響應(yīng)。2.3ctn986-蘆丁、曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取空白小鼠血漿100μl,除不加標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)外,按1.4項(xiàng)下方法操作,進(jìn)樣20μl,得色譜圖,如圖3A;將CTN986、蘆丁和曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(相當(dāng)血漿濃度為4.0ng/ml)和內(nèi)標(biāo)溶液(500ng/mlCTN987)加入空白血漿,依同法操作,得色譜圖,如圖3B;取給藥30min后收集的血漿樣品,依同法操作,得色譜圖,如圖3C。結(jié)果表明,空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取空白小鼠血漿100μl,加入CTN986、蘆丁和曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各20μl,其余按1.4項(xiàng)下操作,使CTN986、蘆丁和曲克蘆丁在血漿中的濃度為4,8,16,40,80,160,400,800ng/ml,取20μl進(jìn)行LC-MS/MS分析,記錄色譜圖。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,各待測(cè)物的線性范圍均為4～800ng/ml,最低定量限均為4ng/ml。2.5精密度、準(zhǔn)確度取空白小鼠血漿100μl,加CTN986、蘆丁和曲克蘆丁質(zhì)控溶液20μl,配制成低、中、高(6.0、60.0和600ng/ml)濃度的血漿樣品各6份做為質(zhì)控樣品,連續(xù)測(cè)定3d,其余按1.4項(xiàng)下方法操作,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行,計(jì)算QC樣品濃度,與配制濃度對(duì)照,求得本法的精密度和準(zhǔn)確度,結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,方法的精密度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品定量分析要求。2.6基質(zhì)效應(yīng)的測(cè)定取6只小鼠的空白血漿100μl,按1.4項(xiàng)下方法操作,向揮干后的殘余物中分別加入6、60和600ng/ml的混標(biāo)溶液150μl,渦流混勻后吸取20μl進(jìn)行LC-MS/MS分析,獲得相應(yīng)色譜峰面積M1;另取相應(yīng)濃度的混標(biāo)溶液20μl,進(jìn)行LC-MS/MS分析,獲得相應(yīng)峰面積M2,用M1與M2之比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果比值均在85%～115%之間,表明CTN986、蘆丁和曲克蘆丁在所采用的測(cè)定條件下沒(méi)有明顯的基質(zhì)效應(yīng)。按1.4項(xiàng)下血漿中CTN986、蘆丁和曲克蘆丁的測(cè)定方法,對(duì)低、中、高3個(gè)濃度的樣品進(jìn)行提取回收率考察,3種濃度下CTN986的提取回收率分別為103.8%、98.2%和92.4%;蘆丁的提取回收率分別為84.8%、79.1%和88.9%;曲克蘆丁的提取回收率分別為85.9%、89.9%和99.8%;內(nèi)標(biāo)的提取回收率為102.2%。2.7固相萃取穩(wěn)定性測(cè)定按1.4項(xiàng)下血漿中CTN986、蘆丁和曲克蘆丁的測(cè)定方法,對(duì)低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品室溫放置6h,-20℃冷凍放置25d,經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán),經(jīng)固相萃取處理后室溫放置24h的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果表明,CTN986、蘆丁和曲克蘆丁在這4種情況下均較穩(wěn)定,其測(cè)定值與標(biāo)示濃度的偏差均為-12.1%～14.7%。2.8不同劑量對(duì)小鼠的藥動(dòng)學(xué)行為影響應(yīng)用所建立的LC-MS/MS法,測(cè)定了小鼠口服或靜注CTN986、蘆丁和曲克蘆丁后血漿中待測(cè)物的濃度,并比較了連續(xù)3d灌胃給予P-gp抑制劑維拉帕米后(預(yù)處理組)對(duì)單次口服CTN986、蘆丁和曲克蘆丁(非處理組)在小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為的影響。CTN986、蘆丁和曲克蘆丁的平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖4,藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。由表2數(shù)據(jù)可知,三者的生物利用度均較低,且由低至高的順序依次為蘆丁、曲克蘆丁和CTN986。灌胃給予維拉帕米后CTN986的Cmax提高約10倍,AUC0-∞和T1/2提高約2倍;蘆丁的Cmax提高約3倍,而其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)沒(méi)有明顯變化;曲克蘆丁的Cmax提高約6倍,AUC0-∞提高約2倍,T1/2無(wú)明顯變化。以上數(shù)據(jù)表明,維拉帕米預(yù)處理使CTN986的吸收增加且減緩了其在小鼠體內(nèi)的消除,維拉帕米的預(yù)處理也使曲克蘆丁的吸收增加,由此可初步推測(cè)CTN986和曲克蘆丁可能為P-gp的底物。3固相萃取法與沉淀蛋白法的比較本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)首次建立了同時(shí)測(cè)定小鼠血漿中CTN986、蘆丁和曲克蘆丁血藥濃度的LC-MS/MS法,方法準(zhǔn)確穩(wěn)定,提