病理學(xué)研究進展

病理學(xué)研究進展

病理是醫(yī)學(xué)的一個重要橋梁學(xué)科，已有300多年的歷史。在18和19世紀(jì)初,人們依賴肉眼和簡單的放大鏡觀察病變組織,產(chǎn)生了器官病理學(xué)。1843年,德國病理學(xué)家Virchow將顯微鏡用于觀察病變部位組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變,病理學(xué)進入細(xì)胞病理學(xué),隨著切片技術(shù)和染色技術(shù)的發(fā)明,開創(chuàng)了組織病理學(xué)技術(shù)最基本的組織制片和HE染色常規(guī)技術(shù)。20世紀(jì)50年代出現(xiàn)了生物組織標(biāo)本制備超薄切片技術(shù),病理學(xué)研究從細(xì)胞水平深入到亞細(xì)胞水平,由此產(chǎn)生了超微結(jié)構(gòu)病理。半個多世紀(jì)以來,科學(xué)技術(shù)不斷的進步,許多新知識、新理論廣泛應(yīng)用于病理學(xué)各個領(lǐng)域。特別是近20多年一系列相關(guān)新方法、新技術(shù)的相繼建立以及細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)、現(xiàn)代免疫學(xué)、現(xiàn)代遺傳學(xué)等新興學(xué)科迅速興起,對病理學(xué)科的發(fā)展產(chǎn)生了深遠的影響,帶來了新的理論和技術(shù)。一、免疫組化染色免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對其進行定位、定性及定量研究的一種技術(shù)方法。免疫組織化學(xué)技術(shù)不僅有較高的敏感性、特異性、簡便性等優(yōu)點,還能將形態(tài)學(xué)改變與功能、代謝變化相結(jié)合,基因水平和蛋白質(zhì)水平檢測相結(jié)合,細(xì)胞水平和超微結(jié)構(gòu)水平相結(jié)合,因此,在所有新技術(shù)中,免疫組織化學(xué)技術(shù)是最重要和最具影響力的一種特殊染色方法,被譽為病理學(xué)的“棕色革命”。石蠟組織免疫組化技術(shù)的發(fā)展從單克隆抗體以及以酶標(biāo)抗體法為基礎(chǔ)的高敏感ABC試劑問世到1991年發(fā)明的加熱抗原修復(fù)技術(shù)(AR)成為免疫組化發(fā)展史上重要的里程碑。但免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化量化問題尚未解決,王文勇等探討免疫組化技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化要從免疫組化染色前技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化(組織固定、取材、脫水、包埋的標(biāo)準(zhǔn)化);組織制片標(biāo)準(zhǔn)化;抗原修復(fù)標(biāo)準(zhǔn)化;對照實驗正確設(shè)立;試劑標(biāo)準(zhǔn)化(抗體和檢測系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化);免疫組化具體操作步驟的標(biāo)準(zhǔn)化;免疫組化染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化;醫(yī)學(xué)實驗室認(rèn)證等方面去實現(xiàn)。此外,全自動免疫組化染色儀的使用可以提高標(biāo)準(zhǔn)化程度,減少手工操作染色帶來的人為誤差。從現(xiàn)有科技水平來看,經(jīng)過努力是完全可能建立起一套切實可行的定量免疫組化技術(shù),為當(dāng)代個體化靶向治療以及分子醫(yī)學(xué)提供強有力的工具。二、檢測細(xì)胞異質(zhì)性原位雜交(insituhybridization,ISH)是應(yīng)用標(biāo)記的已知序列核苷酸片段作為探針,通過雜交直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上檢測和定位某一特定的靶DNA或RNA的存在。該方法具有2個特點:1)基因水平的檢測,即直接檢測DNA或RNA;2)可以明確定位,在保存組織結(jié)構(gòu)同時揭示組織細(xì)胞的異質(zhì)性,細(xì)胞基因表達的異質(zhì)性和細(xì)胞器中的區(qū)別定位。原位雜交與免疫組織化學(xué)在具體實驗操作中有許多相似之處。滕孝靜等將自動免疫組化染色儀應(yīng)用于EBER(Epstein-BarrencodedRNAs)原位雜交技術(shù),得到了滿意的染色效果。1986年使用熒光標(biāo)記DNA探針,開啟了熒光原位雜交(FISH)時代,與原位雜交技術(shù)相比,FISH更加安全、快速、特異性好、定位準(zhǔn)確。目前已應(yīng)用于外科病理學(xué)診斷中,為乳腺癌、肺癌、胃癌等實體腫瘤進行早期診斷、個性化治療以及愈合判斷。但FISH技術(shù)操作較為繁瑣且實驗結(jié)果較不穩(wěn)定。陳順平等通過實踐,提出在FISH實驗中控制酶消化的穩(wěn)定以及判斷細(xì)胞消化效果是對操作者必備要求,合適的消化程度是實驗的關(guān)鍵,也是提高雜交率和診斷準(zhǔn)確率的前提。三、原位pcr檢測肺癌pten基因表達原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerasechainreaction,PCR)是將在冷凍或石蠟包埋組織切片、細(xì)胞涂片中的核酸片段進行高效擴增,來檢測細(xì)胞內(nèi)單一拷貝或低拷貝的待測核酸序列。主要應(yīng)用于病原體檢測,內(nèi)源基因檢測,基因突變、基因重排和染色體易位。辛麗紅等應(yīng)用原位PCR技術(shù)檢測肺癌石蠟標(biāo)本PTEN基因DNA表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN基因在肺癌組織中的表達較正常肺組織中的低,而該基因的表達與肺癌的病理類型、組織分化程度、臨床分期,以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。臨床病理最常見的PCR技術(shù)是使用福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)組織進行擴增。鄢麗敏等選取正常甲狀腺FFPE標(biāo)本應(yīng)用“一步法”、酚/氯仿抽提法和試劑盒法提取總DNA,并應(yīng)用傳統(tǒng)PCR法和巢式PCR法對線粒DNA(mtDNA)的D環(huán)區(qū)進行擴增,結(jié)果得出用蛋白酶K消化、酚/氯仿純化法提取的FFPE組織標(biāo)本DNA,質(zhì)量可靠,巢式PCR技術(shù)是從石蠟標(biāo)本中擴增長片段DNA的有效方法。目前的原位PCR方法還有操作復(fù)雜、假陽性、石蠟包埋標(biāo)本擴增效率低、無法精確定量等諸多問題,需要廣大病理工作者在實踐過程中不斷優(yōu)化試驗條件,完善和提高這一技術(shù)。四、生物學(xué)方面的研究顯微切割術(shù)(microdissection)是在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下通過顯微操作系統(tǒng)從冷凍或石蠟包埋組織切片、細(xì)胞涂片上的任一區(qū)域內(nèi)切割下幾百個、幾十個同類細(xì)胞,或單個細(xì)胞甚至目標(biāo)染色體,再進行有關(guān)的分子生物學(xué)方面的研究。其具有高度敏感性和高度特異性的統(tǒng)一,尤其是在需要研究的細(xì)胞只占樣本中細(xì)胞的少數(shù),或者需研究的細(xì)胞呈散在分布時,顯微切割的重要性尤為明顯。目前,激光捕獲顯微切割(LCM)是最先進的組織純化病理技術(shù)。LCM是基于病理形態(tài)進行細(xì)胞純化,可較好地反映體內(nèi)細(xì)胞的基因表達。王文勇等研究證明福爾馬林固定的石蠟切片可作為LCM技術(shù)及后續(xù)DNA分析的材料來源,將其與基因組擴增技術(shù)結(jié)合,可為腫瘤基因組學(xué)和分子病理學(xué)研究提供重要的手段。如今激光捕獲顯微切割技術(shù)已經(jīng)與PCR、蛋白質(zhì)組學(xué)、組織微陣列技術(shù)和臨床病理診斷工作等結(jié)合起來,為我們研究疾病的病因、發(fā)病機制、臨床治療提供更精確的服務(wù)。五、lscm的觀察方法激光掃描共聚焦顯微鏡(1aserscanningconfocalmicroscopy,LSCM)又稱粘附式細(xì)胞儀,是采用激光作為光源,在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦原理和裝置,并利用計算機對所觀測的對象進行數(shù)字圖像處理的一套觀察、分析和輸出系統(tǒng)。LSCM技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率等特點,可進行定性、定量、定時、定位的分析測量。在形態(tài)學(xué)觀察方面,可對標(biāo)本各層分別成像,對活細(xì)胞行無損傷的“光學(xué)切片”,有“顯微CT”之稱。LSCM在抗原表達、熒光定位、樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)等形態(tài)觀察方面有著無可比擬的優(yōu)勢。劉芙蓉等通過LSCM觀察乳腺癌細(xì)胞內(nèi)在雌激素和雌激素受體拮抗劑刺激下,雌激素受體α(ERα)和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(MTA1)發(fā)生的共定位改變,為深入探討ERα和MTA1的分子生物學(xué)作用奠定了初步基礎(chǔ)。LSCM還可以進行細(xì)胞內(nèi)PH值的測量、膜電位測量、光漂白后熒光恢復(fù)技術(shù)、鈣離子的測量。蘇明華等使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)聯(lián)合LSCM研究川芎嗪(TMP)對大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜L型鈣通道電流的作用和對神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響,探討其治療阿爾茨海默病(AD)的機制,結(jié)果表明TMP具有對海馬神經(jīng)元LCa通道和細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放的雙重抑制作用,防止神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣超載,這可能是其治療AD的機制之一。六、微陣列共聚體對不同基因組間dna產(chǎn)業(yè)競爭的影響比較基因組雜交(comparativegenomichybridization,CGH)是在染色體熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),它通過單一的一次雜交實驗即可在整條染色體或染色體區(qū)帶水平對不同基因組間DNA序列拷貝數(shù)的差異進行檢測并定位。二十世紀(jì)末Solinas-Toldo等率先將傳統(tǒng)經(jīng)典的CGH技術(shù)與生物芯片-微陣列技術(shù)相結(jié)合建立了微陣列比較基因組雜交(aCGH)。CGH及aCGH不僅適用于培養(yǎng)細(xì)胞和新鮮組織樣本的研究,還可用于FFPE組織樣本的研究以及因DNA量過少而經(jīng)PCR擴增的樣本的研究,不需制作細(xì)胞的中期染色體。李棟梁等采用全基因組Array-CGH檢測2例FFPE橫紋肌肉瘤組織的DNA拷貝數(shù)變化,Array-CGH及其步驟的優(yōu)化適于FFPE組織材料DNA拷貝數(shù)的檢測,獲得了與文獻報道較為一致的檢測結(jié)果。目前CGH已應(yīng)用于腫瘤發(fā)病的分子機制等方面的研究。七、生物基因芯片生物芯片技術(shù)(biochiptechnique)是通過縮微技術(shù),根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理,將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng),以實現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。因此,生物芯片技術(shù)具有高通量、微型化、自動化、成本低、防污染等特點。按照芯片上固化的生物材料的不同,可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片。自1998年,Kononen和kalloiniemi建立了組織芯片(TMAs)技術(shù)以來,組織芯片已經(jīng)成為病理組織基礎(chǔ)研究中的重要工具,主要應(yīng)用于腫瘤研究。在組織芯片技術(shù)中,幾十至上千不同腫瘤組織樣本被排列在同一石蠟塊上,將分子靶點(DNA、RNA或蛋白質(zhì))作為探針,應(yīng)用免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交或其他分子檢測技術(shù)來分析TMA,從而獲得高通量的原位分析,實驗中既節(jié)省試劑,又能保證條件的一致性并減少不同批次間的誤差。而且,多種不同組織芯片的組合可以快速全面描述有意義的生物標(biāo)志物。基因芯片技術(shù)已用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域,在基礎(chǔ)研究方面可用于基因表達譜分析、基因分型、基因突變和基因組的多態(tài)性的檢測、新基因的尋找、遺傳作圖、重測序等。但目前還不適用于FFPE標(biāo)本,且費用昂貴、實際操作困難,只能局限于實驗室,難以廣泛應(yīng)用臨床病理。但是隨著生物技術(shù)的進步和發(fā)展,通過設(shè)計不同的探針陣列和使用特定的分析法等方法不斷的發(fā)展和改進基因芯片技術(shù),相信不久基因芯片技術(shù)將具有更廣闊的應(yīng)用前景。八、病理學(xué)的發(fā)展:新技術(shù)