ghrelin在青紫藍兔體內(nèi)的分布定位

ghrelin在青紫藍兔體內(nèi)的分布定位

ghrelin是日本科學家kosima等人發(fā)現(xiàn)的1994年人類胃組織中的一個茶多酚含量，它是通過人體和大鼠（ghs-r）的胃組織中發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物的Ghrelin由28個氨基酸組成,而禽類的由26個氨基酸組成。Ghrelin在種系發(fā)生上是高度保守的,人和小鼠僅第11、12位的氨基酸不同,同源性高達92.9%。在體內(nèi)Ghrelin有兩種存在形式,一種是N端去辛?；?另一種是N端辛酰基化,即第3位絲氨酸的N端與十八辛酸以酯鍵連接,它是發(fā)揮生物學功能所必需的,但對未辛?；腉hrelin的作用還不是很清楚。Ghrelin在動物體內(nèi)分布廣泛,有趣的是Aydin等人發(fā)現(xiàn)在植物體內(nèi)也有Ghrelin的表達。Ghrelin與其受體結合后會產(chǎn)生一系列生物學效應,包括調(diào)節(jié)GH分泌、調(diào)節(jié)能量平衡、促進胃酸分泌、調(diào)節(jié)心血管活動、增強免疫應答、抗細胞增殖、影響糖代謝、引起焦慮和改善記憶力、調(diào)節(jié)睡眠、維持睪丸正常功能等多種生物學作用。Ghrelin一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就引起了人們的廣泛關注,但主要集中在對人和鼠的研究,關于Ghrelin在兔體內(nèi)的分布定位尚未有文獻報道。本實驗采用免疫組織化學方法研究了Ghrelin在青紫藍兔(Oryctolaguscuniculus)體內(nèi)的分布定位,為研究Ghrelin在兔體的生理功能提供了形態(tài)學資料。1材料和方法1.1實驗動物3月齡健康青紫藍兔10只,雌雄各半,體重為(2±0.1)kg,購自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院,圈養(yǎng)在同一兔舍內(nèi)分籠單只飼養(yǎng)。1.2uzbiolechnionac第一抗體為羊抗人Ghrelin的多克隆抗體(SC-10368,SantaCruzBiotechnologyInc),購自上海吉泰科技有限公司。兔抗羊SP免疫組化染色試劑盒、中性樹膠封片劑和DAB顯色試劑購自福州邁新生物技術有限公司。1.3心耳組織切片制備實驗動物(青紫藍兔)經(jīng)耳靜脈注射20%氨基甲酸乙酯(5ml/kg)麻醉后,剪開胸壁,暴露心臟,經(jīng)左心室快速灌注0.85%的生理鹽水(含0.075%檸檬酸三鈉),同時剪開右心耳,灌至流出清亮液體為止(大約300ml);然后用0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)新鮮配制的4%多聚甲醛固定液灌注,約2000ml。固定后取腦、脊髓、胃、腸、脾、卵巢和睪丸等器官,材料置于同一固定液后固定約6h。固定好的組織塊經(jīng)0.1mol/LPBS洗兩次(30min/次)后,置于用0.1mol/LPBS配制的25%蔗糖溶液中,放置于4℃。待其下沉后做冰凍切片,切片厚35μm,直接放置于防凍液內(nèi),然后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。切片?套,其中一套用于免疫組化染色,另一套用作陰性對照。1.4免疫法提取抗菌劑切片經(jīng)PBS漂洗20min后,按兔抗羊SP免疫組化染色試劑盒中的程序進行如下操作:①滴加試劑A(過氧化酶阻斷液),室溫下孵育40min;②滴加試劑B(二抗動物非免疫血清),置37℃孵育40min;③滴加一抗(羊抗人Ghrelin多克隆抗體),于37℃孵育3~4h或4℃過夜;④滴加試劑C(生物素標記的第二抗體),室溫孵育30min;⑤滴加試劑D(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液),室溫孵育30min;⑥將顯色盒中的A、B、C試劑各取1滴,加于1ml蒸餾水中,混勻后滴加到切片上,避光顯色,反應3~10min,蒸餾水洗滌,裱貼于載玻片上,晾干后用中性樹膠封片。以上各步(除第二步)之后均用PBS洗3次(10min/次)。免疫組織化學對照實驗:用0.1mol/LPBS代替一抗,其余步驟同上。1.5陽性細胞大小檢測用Olympus雙目顯微鏡對切片進行觀察、拍照。腦核團定位參照兔和貓腦立體定位圖譜確定。應用江蘇捷達801形態(tài)分析軟件對陽性細胞進行分析,各部位均在統(tǒng)一放大倍數(shù)下檢測,每張切片隨機選取5個不同視野,測量陽性細胞的大小。分別計算中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達Ghrelin的核團的神經(jīng)元個數(shù)、胃腸道內(nèi)的陽性細胞密度,結果用平均數(shù)表示。2結果2.1免疫陽性神經(jīng)元的分布Ghrelin免疫陽性神經(jīng)元分布于下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓和脊髓,陽性神經(jīng)元呈深淺不等的棕褐色,胞核淡染或不著色,胞體大小為10~60μm,細胞成群或散在分布(圖版Ⅰ:1~8)。由圖1可知,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中下丘腦內(nèi)出現(xiàn)的免疫陽性細胞最多,主要分布于弓狀核、腹內(nèi)側核、室旁核、背內(nèi)側核和下丘腦外側區(qū)(圖版Ⅰ:1~5),各部位細胞個數(shù)分別為110、76、102、98、100,胞體呈卵圓形、梭形或多邊形,有數(shù)個突起,除腹內(nèi)側核外,其余部位免疫陽性細胞較多。在大腦皮質(zhì),免疫陽性神經(jīng)元主要位于第Ⅴ層,但數(shù)量較少,僅為19個,胞體多呈錐體形,染色較淺(圖版Ⅰ:6)。在延髓,免疫陽性神經(jīng)元分布于迷走神經(jīng)背側運動核(圖版Ⅰ:7),胞體呈多邊形,突起明顯。在脊髓,免疫陽性神經(jīng)元分布于腹側角(圖版Ⅰ:8),為多極神經(jīng)元。2.2腸道免疫陽性細胞的分布在研究的內(nèi)臟器官中,大量的Ghrelin免疫陽性細胞發(fā)現(xiàn)于胃腸道,在脾、卵巢、睪丸中未發(fā)現(xiàn)免疫陽性細胞。在胃內(nèi),Ghrelin免疫陽性細胞定位于黏膜層(圖版Ⅰ:9),主要位于胃底腺區(qū)胃腺的頸部和底部,但在賁門腺區(qū)和幽門腺區(qū)也可見少量免疫陽性細胞。在腸道,Ghrelin免疫陽性細胞數(shù)量較胃內(nèi)少,分布于十二指腸(圖版Ⅰ:10)、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸的黏膜層,陽性細胞呈深淺不等的棕褐色,細胞大小為90~200μm,且陽性細胞表達量從小腸到大腸逐漸減少(圖2)。胃腸道內(nèi)的免疫陽性細胞,根據(jù)其游離面是否到達腔面可分為兩類,即“開放型”細胞(圖版Ⅰ:11)和“閉合型”細胞(圖版Ⅰ:12)。“開放型”細胞呈梭型、錐體型、三角形或多角形,“閉合型”細胞呈圓形或橢圓型。對照實驗僅見背景染色,未發(fā)現(xiàn)陽性細胞的分布(圖版Ⅰ:13)。3討論3.1grt-pcr神經(jīng)元/傳導束Ghrelin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道均有分布,屬于一種腦腸肽。Ghrelin在動物腦內(nèi)的分布定位文獻中已有報道。Hou等研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin陽性神經(jīng)元在大鼠(Rattusnorregicus)腦內(nèi)主要分布于下丘腦弓狀核、室旁核、外側區(qū)、大腦皮質(zhì)、扣帶回。Cowley等報道大鼠腦內(nèi)Ghrelin陽性神經(jīng)元分布于下丘腦外側區(qū)、弓狀核、腹內(nèi)側核、背內(nèi)側核、室旁核、第三腦室室管膜。Miller等報道在成年綿羊(Ovisaries)的下丘腦和后腦存在Ghrelin及生長激素促分泌素受體(GHSR-1a)免疫活性。楊連玉等報道在新生仔豬(Susscrofa)和90日齡生長豬的下丘腦具有GhrelinmRNA分布。本實驗結果與在其他動物中獲得的結果基本相似,如在大腦皮質(zhì)、下丘腦(弓狀核、背內(nèi)側核、室旁核、腹內(nèi)側核和下丘腦外側區(qū))發(fā)現(xiàn)陽性神經(jīng)元,但也存在一些差異,如在兔延髓、脊髓發(fā)現(xiàn)陽性細胞,在第三腦室室管膜未見有陽性神經(jīng)細胞,這表明Ghrelin神經(jīng)元在腦內(nèi)的分布存在種屬差異,也可能與研究使用的方法、使用的抗體或動物的年齡有關。3.2青紫藍兔不同胃內(nèi)grtelin的分布Ghrelin在內(nèi)臟器官的分布定位文獻中已有報道。楊連玉等發(fā)現(xiàn)新生仔豬和90日齡生長豬的胃底部、十二指腸、空腸、回腸、胰、肝、腎、心等部位均有GhrelinmRNA分布。黃治國等報道了不同日齡哈薩克羊和新疆細毛羊下丘腦、垂體、心、肝、胃、十二指腸和背最長肌內(nèi)GhrelinmRNA的表達及發(fā)育性變化。Hayashida等用免疫組織化學法研究了豬、綿羊、馬(Equnscaballus)和牛(Bostarurs)胃內(nèi)Ghrelin的分布定位,發(fā)現(xiàn)這些動物胃內(nèi)Ghrelin的分布與大鼠的一樣,免疫染色細胞密集分布于胃泌酸腺的頸部至底部,但豬的賁門部和幽門部分布也較多。本實驗在青紫藍兔的胃腸道發(fā)現(xiàn)Ghrelin免疫陽性細胞,但在脾、睪丸、卵巢內(nèi)未發(fā)現(xiàn)免疫陽性細胞,表明Ghrelin在內(nèi)臟器官的分布可能存在物種差異,也可能Ghrelin免疫陽性細胞的分布與GhrelinmRNA的分布存在一定差異。本研究小組在另外的研究中發(fā)現(xiàn)GhrelinmRNA在青紫藍兔心、睪丸、卵巢中有表達,其他研究也發(fā)現(xiàn)某些神經(jīng)肽的分布與其mRNA的分布定位有差異,這個問題有待深入研究。就胃腸道內(nèi)的免疫陽性細胞分布的部位和類型而言,青紫藍兔與豬、鼠等動物的基本相似,即胃腸道內(nèi)也存在“閉合型”和“開放型”兩種陽性細胞。有人認為“