病原免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)：香菇多糖對(duì)正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫功能的影響

香菇多糖對(duì)正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫功能的影響實(shí)驗(yàn)背景

香菇多糖是從優(yōu)質(zhì)香菇子實(shí)體中提取的有效活性成分，其中的活性成分是具有分支的β—(1—3)—D—葡聚糖，主鏈由β—(1—3)—連接的葡萄糖基組成，沿主鏈隨機(jī)分布著由β—(1—6)連接的葡萄糖基，呈梳狀結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)背景香菇多糖的作用類似一種宿主免疫增強(qiáng)劑,能夠通過(guò)刺激關(guān)鍵細(xì)胞的成熟、分化和增殖,通過(guò)改善宿主機(jī)體平衡達(dá)到或提高宿主細(xì)胞對(duì)淋巴因子、激素及其它生物活性因子的反應(yīng)性作用。香菇多糖具有多種生物學(xué)和免疫學(xué)活性,除了具有抗腫瘤作用外,還可提高機(jī)體對(duì)多種細(xì)菌、寄生蟲、病毒性感染(包括艾滋病)的抵抗力。研究進(jìn)展T淋巴細(xì)胞——T細(xì)胞導(dǎo)向并有巨噬細(xì)胞參與的免疫佐劑（抗腫瘤主要機(jī)制）。B淋巴細(xì)胞——?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)中有促進(jìn)β淋巴細(xì)胞合成IgG、IgM的能力,并能提高免疫低下者IgA、C3水平,使脾抗體分泌細(xì)胞數(shù)目及特異性花結(jié)形成細(xì)胞數(shù)目增多。巨噬細(xì)胞——增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)MAF（巨噬細(xì)胞活化因子）的反應(yīng)性,尤其在免疫功能抑制的荷瘤小鼠的實(shí)驗(yàn)中更為顯著。NK——體內(nèi)能使脾臟和腹腔的NK細(xì)胞活性增強(qiáng),且與劑量相關(guān)。血管內(nèi)皮——激活內(nèi)皮系統(tǒng),可使炎性細(xì)胞、免疫活性細(xì)胞浸透到腫瘤組織中,并增強(qiáng)腫瘤基質(zhì)的網(wǎng)狀纖維的產(chǎn)生,是發(fā)揮抗腫瘤作用特點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)意義研究發(fā)現(xiàn)中藥香菇多糖能明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。通過(guò)此次研究探究香菇多糖對(duì)正常小鼠與免疫抑制小鼠免疫功能（包括固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答等）的影響。實(shí)驗(yàn)思路整體思路：分別檢測(cè)在3個(gè)不同劑量下香菇多糖對(duì)正常小鼠以及免疫抑制小鼠免疫功能的影響。觀察指標(biāo)：巨噬細(xì)胞吞噬功能、小鼠脾臟NK細(xì)胞活性測(cè)定、B淋巴細(xì)胞增殖能力、DTH(遲發(fā)型超敏反應(yīng))小鼠耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中T淋巴細(xì)胞活性、血清中IL-2、IL-6、TNF、IL-10含量等指標(biāo)的影響。復(fù)合造模法：放射源照射后腹腔注射環(huán)磷酰胺和氯霉素巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定腹腔注射雞紅細(xì)胞后吸取腹腔液測(cè)定吞值百分率和吞噬系數(shù)收集脾細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定OD值分離制備B淋巴細(xì)胞后用MTT法檢驗(yàn)增殖率通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在流式細(xì)胞儀上測(cè)定DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中信號(hào)強(qiáng)度。用ELISA法測(cè)定血清中IL-2，IL-6的含量主要技術(shù)路線免疫抑制小鼠模型NK細(xì)胞活性測(cè)定B淋巴細(xì)胞增殖能力T淋巴細(xì)胞活性測(cè)定IL-2，IL-6含量的測(cè)定材料藥物與試劑香菇多糖，環(huán)磷酰胺，氯霉素，雞紅細(xì)胞，1640培養(yǎng)液，二甲基亞砜，Hank’s液，5%DNFB丙酮，冷PBS，流式抗體PE-Cy7-anti-mouseCD

，F(xiàn)ITC-antimouseB220，PE-anti-mouseCD25，F(xiàn)ITC-antimouseCD69

儀器顯微鏡，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，流式細(xì)胞儀，CO2培養(yǎng)箱，ELISA試劑盒動(dòng)物

Balb/c小鼠[9]200只，體重18～22g，

雌雄各半，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

實(shí)驗(yàn)分組香菇多糖高劑量組正常小鼠空白對(duì)照組香菇多糖中劑量組香菇多糖低劑量組再隨機(jī)分成a1，a2，a3，a4，a5，共5組再隨機(jī)分成d1，d2，d3，d4，d5，共5組再隨機(jī)分成b1，b2，b3，b4，b5，共5組再隨機(jī)分成c1，c2，c3，c4，c5，共5組實(shí)驗(yàn)分組香菇多糖高劑量組免疫抑制小鼠空白對(duì)照組香菇多糖中劑量組香菇多糖低劑量組再隨機(jī)分成e1，e2，e3，e4，e5，共5組再隨機(jī)分成h1，h2，h3，h4，h5，共5組再隨機(jī)分成f1，f2，f3，f4，f5，共5組再隨機(jī)分成g1，g2，g3，g4，g5，共5組實(shí)驗(yàn)分組a1,b1,c1,d1,e1,f1,g1,h1組小鼠給藥后腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中T淋巴細(xì)胞活性測(cè)定

脾臟NK細(xì)胞活性測(cè)定測(cè)定B細(xì)胞增殖能力測(cè)定a2,b2,c2,d2,e2,f2,g2,h2組小鼠a3,b3,c3,d3,e3,f3,g3,h3組小鼠a4,b4,c4,d4,e4,f4,g4,h4組小鼠a5,b5,c5,d5,e5,f5,g5,h5組小鼠血清中IL-2，IL-6含量檢測(cè)腹腔注射給藥香菇多糖

(1)香菇多糖高劑量組(10mg/kg?d,0.2mL/d);(2)香菇多糖中劑量組(5mg/kg?d,0.2mL/d);(3)香菇多糖低劑量組(1mg/kg?d,0.2mL/d);生理鹽水（空白對(duì)照組）方法及劑量同上，但藥物為生理鹽水腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定實(shí)驗(yàn)[1]

腹腔注射雞紅細(xì)胞頸椎脫臼法處死腹腔注入無(wú)菌生理鹽水2mL，輕揉后吸取1mL滴片，置濕盒中37℃恒溫水浴生理鹽水漂洗并自然干燥染色后計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)小鼠脾臟NK細(xì)胞活性測(cè)定[4]收集小鼠脾臟細(xì)胞,配制成細(xì)胞懸液加于96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板，每只小鼠6孔試驗(yàn)孔內(nèi)加靶細(xì)胞懸液，另設(shè)3孔作為靶細(xì)胞對(duì)照組混勻,置37℃5%CO2

培養(yǎng)箱內(nèi)2h加MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4h吸棄上清液后加二甲基亞砜，充分振蕩酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570nm處測(cè)OD值，換算成NK細(xì)胞的活性B淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（3）制備脾細(xì)胞懸液B淋巴細(xì)胞分離MTT法檢測(cè)B淋巴細(xì)胞增殖率（%）=[(B－C)/C]×100%。式中B為刺激孔吸光度值，C為對(duì)照孔吸光度值。DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中T淋巴細(xì)胞活性測(cè)定（5）給藥后第2天，用DNFB丙酮涂抹致敏小鼠給藥第7天，小鼠右耳用DNFB丙酮攻擊，右耳用丙酮對(duì)照攻擊30h后，處死取耳片耳片稱重，計(jì)算耳腫脹度取出右耳后淋巴結(jié)和小腸排派氏結(jié)，制成淋巴細(xì)胞懸液分別加入兩套流氏管中，一套加PE-Cy7-anti-mouseCD3和FITC-antimouseB220兩種流氏抗體，另一套加PE-Cy7-anti-mouseCD3，PE-anti-mouseCD25和FITC-antimouseCD69兩種流氏抗體混勻后室溫避光孵育,冷PBS洗滌細(xì)胞離心、重懸細(xì)胞后，上機(jī)檢測(cè)血清中IL-2、IL-6、TNF、IL-10含量的檢測(cè)（3）小鼠取眼球取血離心10min取血清，檢測(cè)其中IL-2、IL-6的含量，用ELISA法檢測(cè)IL-10的濃度實(shí)驗(yàn)流程小鼠隨機(jī)分組連續(xù)給藥7天再次隨機(jī)分組驗(yàn)證假說(shuō)，討論統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)分別檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)預(yù)期結(jié)果香菇多糖對(duì)正常小鼠和免疫抑制小鼠的免疫功能均有增強(qiáng)作用，包括非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫,且

在一定的濃度范圍內(nèi)存在量效正相關(guān)性,并且對(duì)免疫抑制小鼠效果為佳。具體表現(xiàn)如下：巨噬細(xì)胞吞噬功能——與空白對(duì)照組相比，香菇多糖對(duì)正常小鼠以及免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)有顯著提高，且隨著劑量的增加而增大影響，且對(duì)免疫抑制小鼠更為明顯。脾臟NK細(xì)胞活性——經(jīng)香菇多糖注射的正常小鼠和免疫抑制小鼠,NK細(xì)胞活性明顯高于本組內(nèi)普通飼料（空白對(duì)照）喂養(yǎng)的小鼠，且隨著劑量的增加而增大影響,且對(duì)免疫抑制小鼠更為明顯。預(yù)期結(jié)果B淋巴細(xì)胞增殖能力——免疫抑制后小鼠B淋巴細(xì)胞增殖率明顯降低；但給藥后，香菇多糖中、高劑量組小鼠B淋巴細(xì)胞增殖率明顯提高，且對(duì)免疫抑制小鼠更為明顯。T淋巴細(xì)胞活性——對(duì)正常小鼠和免疫抑制小鼠，香菇多糖均能有效增強(qiáng)小鼠DTH反應(yīng),降低耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)的T細(xì)胞比例,提高T細(xì)胞活化水平

,且隨著劑量的增加而增大影響,且對(duì)免疫抑制小鼠更為明顯血清中IL-2、IL-6——免疫抑制后小鼠血清中IL-2、IL-4的含量明顯降低；但給藥后，香菇多糖中、高劑量組小鼠血清中IL-2、IL-4的含量，且對(duì)免疫抑制小鼠更為明顯。討論香菇多糖是典型的T細(xì)胞激活劑,體內(nèi)外均能促進(jìn)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,提高其殺傷活力,增強(qiáng)正常或免疫功能低下的小鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。香菇多糖在體內(nèi)首先誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生急相蛋白誘導(dǎo)因子(APPIF),隨后血清中出現(xiàn)血管膨脹出血誘導(dǎo)因子、白細(xì)胞介素1誘導(dǎo)因子、IL-3等。這些因子再作用于淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等,導(dǎo)致與免疫和炎癥有關(guān)的許多免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。另外,香菇多糖還能激活補(bǔ)體系統(tǒng),促進(jìn)抗體形成,使巨噬細(xì)胞溶酶體酶和IL-1分泌量增加,而抑制巨噬細(xì)胞釋放PGE、PGF（免疫系統(tǒng)抑制劑）。腹腔注射環(huán)磷酰胺可以殺傷體內(nèi)的免疫細(xì)胞,有效抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。本實(shí)驗(yàn)中,腹腔注射85mg/kg環(huán)磷酰胺可以明顯抑制小鼠的DTH反應(yīng),升高耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中T細(xì)胞的比例,降低其活化水平,有效抑制系統(tǒng)免疫和腸道粘膜免疫。以上結(jié)果表明：香菇多糖能全方面增加正常小鼠與免疫抑制小鼠的免疫功能。這可能是香菇多糖抗腫瘤的機(jī)理之一。參考文獻(xiàn)[1]蘆殿榮,祝彼得,蘆殿香,劉嘯,馮雪梅,金沈銳.香菇多糖對(duì)正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,21(4):20-22.[2]程戰(zhàn).當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)細(xì)胞及體液免疫的調(diào)節(jié)作用[J].遼寧中醫(yī)雜志,2000,27(9):426-427.[3]王巖.毛頭鬼傘多糖對(duì)體液免疫調(diào)節(jié)作用的研究[4]鮑建芳,邵傳森,沈建根,詹勇.糖萜素對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性影響的研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào),2001,30(6):261-263.[5]江益平,徐曉飛,周聯(lián),白莎莎,董燕.香菇多糖口服和注射給藥對(duì)DTH小鼠耳后淋巴結(jié)和小腸派氏結(jié)中