雙熒光素酶染色質(zhì)免疫共沉淀

雙熒光素酶

染色質(zhì)免疫共沉淀檢測原理luciferinoxyluciferin熒光素酶（luciferase）可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在反應(yīng)過程中會發(fā)出生物熒光，然后通過熒光測定儀器測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光量，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理計，算出被測樣品中l(wèi)uciferase的含量。通過熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。其是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。應(yīng)用原理1.構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。2.將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞或其它相關(guān)的細胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。3.加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。查找靶基因啟動子序列consiteMapper2.0TFsearch技術(shù)流程1.用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。2.設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。3.篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。4.擴增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時準備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用。5.培養(yǎng)293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。6.將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。7.提取蛋白并用于熒光素酶檢測。（Promega試劑盒）8.加入底物，測定熒光素酶的活性。9.計算相對熒光強度，并與空載對照比較。CHIP簡介染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達關(guān)系。CHIP原理在活細胞狀態(tài)下把細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)，超聲波將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后用所研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體免疫沉淀蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體，從而特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。技術(shù)示意圖1、甲醛交聯(lián)細胞2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10min。每1min顛倒搖動一次離心管。2.把DNA粉碎為長度200-600bp，置于冰上