針刺調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能的穴位特異性研究

針刺調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能的穴位特異性研究

近年來(lái)，關(guān)于針灸與下肢-腎上腺皮質(zhì)（hpa）軸功能的研究很多，但問(wèn)題是：（1）這些研究主要集中在特定或多個(gè)穴位對(duì)hpa軸功能和機(jī)制的分析上。（2）不同類(lèi)型的針灸選擇相似。關(guān)于針灸穴位特異性研究涉及較少,對(duì)臨床針灸選穴原則的確立指導(dǎo)意義不大。已有的研究表明,調(diào)節(jié)應(yīng)激的不同輸入信號(hào)在下丘腦室旁核(PVN)的小細(xì)胞神經(jīng)元匯合。這些神經(jīng)元合成并釋放下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropinreleasinghormone,CRH))和血管加壓素,代表神經(jīng)激素對(duì)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)酮釋放調(diào)節(jié)的固定終級(jí)共同通路。因此,我們以此種產(chǎn)生“應(yīng)激的刺激”作為對(duì)照,遴選和驗(yàn)證能特異性調(diào)節(jié)下丘腦CRH神經(jīng)元功能活動(dòng)的有效穴位。本研究以針刺同一經(jīng)脈不同神經(jīng)節(jié)段、相同或相鄰神經(jīng)節(jié)段不同經(jīng)脈上的20個(gè)穴位激活下丘腦室旁核區(qū)特異分泌CRH相關(guān)神經(jīng)元電活動(dòng)的強(qiáng)度差異為指標(biāo),遴選這種效應(yīng)的特異性相關(guān)穴位。并通過(guò)觀察不同針刺次數(shù)刺激特異性相關(guān)穴位,在不同時(shí)間點(diǎn)外周血皮質(zhì)酮水平的變化,探討針刺對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)是否具有累積效應(yīng)。1材料和方法1.1豐隆穴穴神經(jīng)刺激儀監(jiān)測(cè)結(jié)果液壓微電極操縱器(SM-25C日本),微電極輸入DAM50(美國(guó)WPI公司),POWERLab生物機(jī)能信號(hào)采集分析處理系統(tǒng)(澳大利亞ADInstruments生產(chǎn)),光譜掃描多功能酶標(biāo)儀(ThermoScientificVarioskanFlash,美國(guó)),韓式穴位神經(jīng)刺激儀(HANS-200B)。烏拉坦(湖北盈和化工有限公司),肝素(海納肝素鈉生產(chǎn)公司),氫化可的松(Sigma公司,純度≥99%),ELISA試劑盒(CSB-E07014r,武漢華美)。1.2皮膚組織病理學(xué)觀察,進(jìn)行腦圖檢測(cè)雄性成年SD大鼠,體質(zhì)量240~280g,中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCSK-2002-0016,為普通級(jí)動(dòng)物。標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飼料分籠喂養(yǎng),室溫(20±2)℃,光照12h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理及倫理委員會(huì)的規(guī)定。10%烏拉坦麻醉(腹腔注射,1.1mL/100g)。右側(cè)頸部剪毛,碘酒、酒精消毒后沿頸靜脈走行剪開(kāi)頸部皮膚(<1cm),分離頸靜脈至遠(yuǎn)心端及遠(yuǎn)心端分支處,于遠(yuǎn)心端套線(4-0)牽拉頸靜脈,用細(xì)塑料管(Φ0.2cm)緩慢插入頸靜脈向心端,固定,觀察無(wú)滲血后4-0線縫合切口。細(xì)塑料管另一端與三通相連,分別給予1%肝素及氫化可的松注射液(先用無(wú)水乙醇配成濃縮液,使用時(shí)再用0.9%氯化鈉溶液稀釋,10mg/kg靜脈注射)。全部操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。在上述手術(shù)完成后,將大鼠移至KOPF-900型大鼠立體定位儀上,呈俯臥位,雙耳用耳棒固定,上齒鉤掛在鼠頭夾中,口鼻部用鼠頭夾夾緊。于顱正中線縱向切開(kāi)皮膚,分離切除皮下組織,去除骨膜,暴露出前后囟,將前后囟調(diào)至同一水平面。參照大鼠腦圖譜(Paxions和Watson,2006)標(biāo)定PVN在顱骨二維坐標(biāo)的位置:后囟前6.9~7.4mm,旁開(kāi)約0.4~0.9mm。在此范圍中央先用顱骨鉆鉆開(kāi)一小孔,再用咬骨鉗沿鉆開(kāi)的小孔小心剔除約5mm×3mm顱頂骨,然后在顯微鏡下用游絲鑷去除腦膜。1.3實(shí)驗(yàn)大鼠血清中crh相關(guān)穴位的激活采用充灌1%滂胺天藍(lán)的玻璃微電極(尖端小于0.5μm,阻抗為15~20MΩ),在液壓微電極操縱器控制下根據(jù)PVN三維空間坐標(biāo)定位(后囟前6.9~7.4mm,旁開(kāi)約0.4~0.9mm,深度約前后囟水平下7.3~8.3mm),將記錄微電極插入PVN,當(dāng)記錄微電極在PVN記錄到神經(jīng)元放電時(shí),分別進(jìn)行以下操作。熱水(48℃)浸燙大鼠2/3尾巴,如果神經(jīng)元電活動(dòng)增強(qiáng)(比基礎(chǔ)電活動(dòng)增加20%以上),待神經(jīng)元電活動(dòng)恢復(fù)后再給予靜脈注射氫化可的松注射液,如果神經(jīng)元電活動(dòng)出現(xiàn)抑制反應(yīng)(比基礎(chǔ)電活動(dòng)減少20%以上),即假設(shè)該神經(jīng)元為與CRH相關(guān)神經(jīng)元,并以該神經(jīng)元放電為指標(biāo),觀察分別針刺不同部位、不同經(jīng)脈的20個(gè)穴位對(duì)該神經(jīng)元的激活效應(yīng)及強(qiáng)度的差異,遴選針刺激活該神經(jīng)元的特異性相關(guān)穴位。不同穴位刺激需間隔一定時(shí)間,前一個(gè)穴位刺激后,待神經(jīng)元電活動(dòng)恢復(fù)基礎(chǔ)放電后,再進(jìn)行下一個(gè)穴位的刺激。記錄的神經(jīng)元電活動(dòng)經(jīng)微電極輸入微電極放大器后引入POWERLab生物機(jī)能信號(hào)采集分析處理系統(tǒng),將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)傳輸給計(jì)算機(jī),并對(duì)數(shù)字進(jìn)行分析。1.4不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物電刺激活率測(cè)定,分別與模型材料法相關(guān)、電刺激和或無(wú)電刺激在明確特異性相關(guān)穴位基礎(chǔ)上,選用正常成年SD雄性大鼠20只,分別設(shè)電針組(電針刺激條件:5/100Hz疏密波,2mA,30min/次)與對(duì)照組,每組10只。在動(dòng)物清醒狀態(tài)下,分別在1、3、5、7、9d于“腎俞”施以電針刺激,對(duì)照組接受相同的針刺,只是無(wú)電刺激,從0d(針刺治療前)開(kāi)始每日在相同時(shí)間取尾靜脈血1mL。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血漿皮質(zhì)酮,以探討針刺次數(shù)與血清皮質(zhì)酮水平的關(guān)系,觀察針刺調(diào)節(jié)HPA軸功能是否具有累積效應(yīng)。1.5“門(mén)”“法”“中”、“里”“有“里””“有“門(mén)”“有“門(mén)”“有“門(mén)”“有“門(mén)””“有“門(mén)”“有“門(mén)””“有“門(mén)”、“承山”參考文獻(xiàn)方法,取穴“腎俞”、“期門(mén)”、“肝俞”、“大椎”、“章門(mén)”、“腹哀”、“太乙”、“郄門(mén)”、“水溝”、“商曲”、“腹通谷”、“足三里”、“太沖”、“內(nèi)關(guān)”、“京門(mén)”、“陽(yáng)陵泉”、“三陰交”、“膻中”、“筑賓”、“承山”。1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以—x±s表示,組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1個(gè)穴位對(duì)細(xì)胞電活動(dòng)的影響針刺后PVNCRH相關(guān)神經(jīng)元放電比基礎(chǔ)放電增加由大到小的順序:“腎俞”>“期門(mén)”>“肝俞”>“大椎”>“章門(mén)”>“腹哀”>“太乙”>“郄門(mén)”>“水溝”>“商曲”>“腹通谷”>“足三里”>“太沖”>“內(nèi)關(guān)”>“京門(mén)”>“陽(yáng)陵泉”>“承山”>“筑賓”>“三陰交”>“膻中”。見(jiàn)圖1、表1。本研究觀察到,上述20個(gè)穴位在不同程度上均能激活下丘腦CRH相關(guān)神經(jīng)元電活動(dòng),這與以往的報(bào)道有相似之處,但同時(shí)發(fā)現(xiàn),在一定刺激強(qiáng)度下,下丘腦CRH相關(guān)神經(jīng)元的調(diào)節(jié)存在穴位特異性。其中“腎俞”與“水溝”、“足三里”、“陽(yáng)陵泉”、“內(nèi)關(guān)”、“承山”、“筑賓”、“三陰交”、“膻中”比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;“期門(mén)”與“膻中”、“陽(yáng)陵泉”、“三陰交”、“承山”、“筑賓”、“太沖”比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;“肝俞”與“三陰交”、“膻中”比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2不同時(shí)間和不同次數(shù)的電針“對(duì)外周皮質(zhì)的影響”見(jiàn)表23麻醉刺激和針刺激活pvn神經(jīng)元下丘腦作為內(nèi)分泌系統(tǒng)的啟動(dòng)因素,在HPA軸中起關(guān)鍵作用。下丘腦CRH的神經(jīng)胞體主要分布在PVN,在受到應(yīng)激刺激時(shí),PVN的小細(xì)胞神經(jīng)元分泌CRH,有直接激活HPA軸的作用。HPA軸作為神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的樞紐,在機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的維持中起重要的作用。陳氏等用麻醉大鼠模型研究針刺“腎俞”對(duì)下丘腦PVN神經(jīng)元功能狀態(tài)的影響,結(jié)果顯示,麻醉刺激對(duì)PVN神經(jīng)元具有影響,電針刺激“腎俞”對(duì)PVN神經(jīng)元的激活作用是在麻醉刺激基礎(chǔ)上的進(jìn)一步加強(qiáng),且對(duì)PVN部位多種神經(jīng)元均具有激活作用。另有研究表明,針刺“環(huán)跳”能激活PVNCRH神經(jīng)元,抑制炎性水腫;針刺“天樞”和“上巨虛”能緩解腸應(yīng)激綜合征與下丘腦CRH的表達(dá)降低有關(guān)。周氏等研究發(fā)現(xiàn),針刺抑制HPA軸的關(guān)鍵激活環(huán)節(jié)是PVNCRH及其受體表達(dá)。這些結(jié)果為針刺調(diào)節(jié)HPA軸功能活動(dòng)的穴位特異性研究提供了線索,即可以通過(guò)比較不同穴位針刺對(duì)下丘腦CRH神經(jīng)元的激活效應(yīng),遴選出與HPA軸功能活動(dòng)有特異性聯(lián)系的穴位。3.1針刺調(diào)節(jié)hpa軸功能首先分析不同經(jīng)脈位于相同或相鄰脊髓神經(jīng)節(jié)段的穴位對(duì)下丘腦CRH相關(guān)神經(jīng)元的調(diào)節(jié)效應(yīng)。(1)與腎上腺位于相同或相鄰神經(jīng)節(jié)段的不同經(jīng)脈的穴位——膀胱經(jīng)的“腎俞”、“肝俞”,膽經(jīng)的“京門(mén)”,胃經(jīng)的“太乙”,腎經(jīng)的“商曲”、“腹通谷”,肝經(jīng)的“期門(mén)”、“章門(mén)”,脾經(jīng)的“腹哀”比較,無(wú)顯著差異;但位于不同神經(jīng)節(jié)段的督脈的“大椎”、“水溝”與上述穴位相比亦無(wú)顯著差異,而任脈的“膻中”有顯著差異;(2)位于四肢的相同或相鄰神經(jīng)節(jié)段不同經(jīng)脈的穴位——胃經(jīng)的“足三里”、肝經(jīng)的“太沖”、膽經(jīng)的“陽(yáng)陵泉”、脾經(jīng)的“三陰交”、膀胱經(jīng)的“承山”、腎經(jīng)的“筑賓”,以及心包經(jīng)的“郄門(mén)”、“內(nèi)關(guān)”之間相比無(wú)顯著差異,但與“腎俞”、“期門(mén)”相比有顯著差異。其次分析同一經(jīng)脈不同神經(jīng)節(jié)段的穴位調(diào)節(jié)效應(yīng):肝經(jīng)的“期門(mén)”與“太沖”之間,膀胱經(jīng)的“腎俞”與“承山”之間有顯著差異;胃經(jīng)的“太乙”與“足三里”之間、脾經(jīng)的“腹哀”與“三陰交”之間、膽經(jīng)的“京門(mén)”與“陽(yáng)陵泉”之間、腎經(jīng)的“商曲”及“腹通谷”與“筑賓”之間、督脈的“大椎”與“水溝”之間、心包經(jīng)的“內(nèi)關(guān)”與“郄門(mén)”之間均無(wú)顯著差異。綜合以上結(jié)果:在膀胱經(jīng)、肝經(jīng)不同神經(jīng)節(jié)段存在穴位的特異性,說(shuō)明在特異性經(jīng)脈上存在特異性相關(guān)穴位。此外,不同神經(jīng)節(jié)段,不同經(jīng)脈穴位之間:“腎俞”與“足三里”、“陽(yáng)陵泉”、“承山”、“筑賓”、“內(nèi)關(guān)”、“太沖”、“三陰交”及“膻中”比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.001),“期門(mén)”與“陽(yáng)陵泉”、“承山”、“筑賓”、“太沖”、“三陰交”及“膻中”比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),“肝俞”與“三陰交”、“膻中”比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。綜合以上研究發(fā)現(xiàn):針刺調(diào)節(jié)HPA軸功能既有穴位特異性,又有經(jīng)脈特異性。“腎俞”為特異性相關(guān)穴位,其次為“期門(mén)”、“肝俞”;膀胱經(jīng)為特異性相關(guān)經(jīng)脈,其次為肝經(jīng)?！澳I俞”、“肝俞”是膀胱經(jīng)穴位,與腎經(jīng)為表里經(jīng)穴,其穴位所在部位與腎上腺為相同的神經(jīng)節(jié)段支配,因此其調(diào)節(jié)效應(yīng)有經(jīng)脈的效應(yīng)及神經(jīng)節(jié)段支配的效應(yīng),故調(diào)節(jié)效應(yīng)最明顯;“期門(mén)”為肝經(jīng)穴位,肝主疏泄,調(diào)情定志,其穴位所在部位與腎上腺為相鄰的神經(jīng)節(jié)段支配。而本項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)針刺腎經(jīng)及任脈的穴位對(duì)該神經(jīng)元的激活效應(yīng)沒(méi)有膀胱經(jīng)明顯,其原因尚無(wú)法解釋,有待今后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。3.2應(yīng)激刺激與外周血皮質(zhì)酮水平的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了觀察不同針刺次數(shù)刺激靶穴位“腎俞”,在不同時(shí)間點(diǎn)外周血皮質(zhì)酮水平的變化。結(jié)果表明,電針刺激“腎俞”能明顯提高外周血皮質(zhì)酮水平,對(duì)照組亦有增高的趨勢(shì),但與針刺前相比無(wú)顯著差異。說(shuō)明皮質(zhì)酮水平的提高與刺激強(qiáng)度有密切關(guān)系。值得注意的是:第2次電針刺激后皮質(zhì)酮水平較第1次電針刺激后明顯增高,但第3次、第4次刺激后皮質(zhì)酮水平?jīng)]有增高的表現(xiàn),與針刺前無(wú)顯著差異。從另一方面說(shuō)明