基于近紅外光譜技術(shù)的丹酚酸b含量檢測(cè)模型的建立

基于近紅外光譜技術(shù)的丹酚酸b含量檢測(cè)模型的建立

中國(guó)目前的中藥生產(chǎn)工藝控制模式很少考慮過(guò)程中組件和含量的變化，這基本上是基于傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)控制方法。同時(shí)，產(chǎn)品的在線檢測(cè)方法不能滿足生產(chǎn)過(guò)程中在線檢測(cè)的需要。實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程的在線實(shí)時(shí)質(zhì)量監(jiān)控是保證中藥質(zhì)量穩(wěn)定、均一的關(guān)鍵,也是實(shí)現(xiàn)中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化的技術(shù)瓶頸。近紅外光譜(nearinfrared,NIR)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種快速分析技術(shù),它是被測(cè)樣品的物質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)信息的間接體現(xiàn)。樣品NIR光譜的獲取操作簡(jiǎn)便且成本低,無(wú)須復(fù)雜的樣品前處理,符合在線檢測(cè)的要求。隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,NIR技術(shù)在農(nóng)業(yè)和石油工業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。2002年,美國(guó)FDA把該項(xiàng)技術(shù)作為一種標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法,2005版《中國(guó)藥典》已將“近紅外分光光度法指導(dǎo)原則”列入目錄。近年來(lái),NIR技術(shù)在中藥行業(yè)特別是中藥生產(chǎn)過(guò)程的在線檢測(cè)逐漸成為研究熱點(diǎn),有學(xué)者應(yīng)用其檢測(cè)丹參水提過(guò)程丹參酮和丹酚酸B的含量,也有對(duì)梔子藥材提取和三七總皂苷模擬物系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析,最近還有應(yīng)用NIR技術(shù)對(duì)黃連和枳殼提取物的純化過(guò)程進(jìn)行快速分析的報(bào)道,但這些僅局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的模擬生產(chǎn)研究,基于生產(chǎn)規(guī)模的中藥純化過(guò)程的近紅外在線檢測(cè)技術(shù)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)丹酚酸B的關(guān)鍵工序—純化過(guò)程作為研究系統(tǒng),以洗脫液中的主要有效成分-丹酚酸B的含量變化作為研究對(duì)象,利用NIR在線檢測(cè)技術(shù)采集光譜,并結(jié)合HPLC檢測(cè)技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)的數(shù)據(jù)處理方法,建立純化過(guò)程的丹酚酸B含量檢測(cè)模型,實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程的全程實(shí)時(shí)質(zhì)量監(jiān)控。1設(shè)備和材料1.1tqanalyst分析軟件傅立葉近紅外分析儀(美國(guó)Thermo公司),配有光纖配件及TQAnalyst分析軟件;Agilent1100高效液相色譜儀(美國(guó)HP公司);150L不銹鋼層析裝置(天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司)。1.2藥品、試劑與標(biāo)準(zhǔn)丹參(陜西商洛),經(jīng)天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司質(zhì)檢部鑒定為丹參SalviamiltiorrhizaBge;丹酚酸B對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈為色譜純(默克公司);甲酸為分析純(天津化學(xué)試劑有限公司)。2原則和方法2.1近紅外光譜特征信息近紅外光是介于可見(jiàn)光和中紅外光之間的電磁波,美國(guó)材料檢測(cè)學(xué)會(huì)將近紅外光譜區(qū)的范圍定義為780~2526nm(12820~3959cm-1),是人們最早發(fā)現(xiàn)的非可見(jiàn)光。它的光譜區(qū)與有機(jī)分子中含氫基團(tuán)(OH、NH、CH)振動(dòng)的合頻和各級(jí)倍頻的吸收區(qū)相一致,通過(guò)掃描樣品的近紅外光譜,可以得到樣品中有機(jī)分子含氫基團(tuán)的特征信息。不同基團(tuán)或同一基團(tuán)在不同化學(xué)環(huán)境中的近紅外吸收波長(zhǎng)與強(qiáng)度都有明顯差別。因此近紅外光譜具有豐富的樣品結(jié)構(gòu)和組成信息,適用于天然產(chǎn)物活性成分的品質(zhì)檢測(cè)。由于近紅外光譜吸收譜帶較寬且重疊嚴(yán)重,必須使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取近紅外光譜特征信息。本研究以HPLC確定待測(cè)組分的含量,應(yīng)用偏最小二乘法(PLS)建立組分含量與NIR光譜間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型,實(shí)現(xiàn)對(duì)丹酚酸B生產(chǎn)過(guò)程的在線檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控。2.2方法2.2.1藥渣聚酰胺樹(shù)脂純化稱取丹參藥材共50kg,置于500L提取罐中,加5.5倍量水,煎煮提取1h,放液;藥渣進(jìn)行第2次提取,加入3倍量水,煎煮提取0.5h,放液。提取液混合并經(jīng)過(guò)處理后,用聚酰胺樹(shù)脂純化,流速為1BV/H。在純化過(guò)程中每隔一定時(shí)間在線采譜1次,同時(shí)取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)。2.2.2麻黃苯磺酸鹽的光譜特性光譜采集方式:對(duì)純化過(guò)程每隔2~5min采譜1次,每次采集2張譜圖;采譜的同時(shí)取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè),樣品編號(hào)一一對(duì)應(yīng)。光譜采集條件:掃描范圍:10000~4000cm-1,掃描次數(shù)32,分辨率8cm-1。丹參洗脫液的近紅外譜圖參見(jiàn)圖1。在譜圖采集過(guò)程中,流通池中的樣品存在氣泡,一直是困擾試驗(yàn)進(jìn)行的大問(wèn)題,因?yàn)槠渲苯佑绊懙焦庑盘?hào)在流通池中的吸收與傳播,造成采集到的光譜出現(xiàn)不規(guī)則峰型,譜圖信息受到嚴(yán)重干擾。針對(duì)該問(wèn)題,作者從設(shè)備、現(xiàn)場(chǎng)操作等方面入手,經(jīng)過(guò)試驗(yàn)和摸索,避免了氣泡的干擾現(xiàn)象,掃清了在線采譜的最大障礙。2.2.3對(duì)照品溶液的制備色譜條件:色譜柱為AgilentZORBAXSB-C18(5μm,4.6mm×250mm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸-水=30∶10∶1∶59;檢測(cè)波長(zhǎng)286nm;流速1ml/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量5μl。對(duì)照品溶液的制備:精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量,加75%甲醇制成濃度約為0.14mg/ml的溶液。供試品溶液的制備:精密量取適量洗脫液,用75%甲醇稀釋至10ml,搖勻,用0.45μm濾膜過(guò)濾,取濾液即得。3結(jié)果3.1方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)在近紅外光譜的采集過(guò)程中,環(huán)境的變化會(huì)引起光譜的基線偏移,隨機(jī)噪聲和樣品背景干擾都會(huì)對(duì)校正結(jié)果產(chǎn)生影響,因此需要對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。本研究將各種光譜預(yù)處理方法排列組合,考察其對(duì)純化模型相關(guān)系數(shù)(r)、均方差(RMSEC)及內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)的影響。結(jié)果見(jiàn)表1。使用的預(yù)處理方法有多元散射校正(MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正交變換(SNV)、一階微分(FD)、二階微分(SD)、savitzky-gdcey濾波平滑(S-G)和Norris導(dǎo)數(shù)濾波平滑(Norris)等。根據(jù)表中的計(jì)算結(jié)果,最終選擇FD+Norris的光譜預(yù)處理方式建立模型。3.2模型的交叉驗(yàn)證采用PLS法建立定量模型時(shí),為避免出現(xiàn)“過(guò)擬合”現(xiàn)象,需要對(duì)主因子數(shù)進(jìn)行合理選擇。本研究采用留一交叉驗(yàn)證法,考察了主因子數(shù)對(duì)內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)的影響。模型的交叉驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出,當(dāng)主因子數(shù)為6時(shí),RMSECV為4.42,超過(guò)此主因子數(shù)時(shí),RMSECV不下降反而有所上升,因此確定最佳主因子數(shù)為6。3.3最佳算法的選擇光譜范圍的選擇在NIR定量分析模型的建立中是最難的一步。迄今為止,化學(xué)計(jì)量學(xué)領(lǐng)域還沒(méi)有一個(gè)完美的算法來(lái)選擇最佳的光譜范圍。本研究在去除吸收飽和波段及噪聲較大的部分波段后,通過(guò)比較,選取吸收特征較為明顯的9815~5430cm-1波段作為建立模型的最佳光譜范圍,模型的相關(guān)系數(shù)及預(yù)測(cè)效果良好。3.4丹酚酸b含量的pls建模本研究對(duì)6批次丹酚酸B純化過(guò)程的251個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用一階微分光譜對(duì)丹酚酸B含量進(jìn)行PLS建模。根據(jù)交叉驗(yàn)證獲得的結(jié)果如下:最佳主因子數(shù)為6,相關(guān)系數(shù)R=0.9776,RMSEC=4.02。模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的相關(guān)系數(shù)圖見(jiàn)圖3。3.5異常數(shù)據(jù)點(diǎn)的純化為了驗(yàn)證上述模型的預(yù)測(cè)效果,參照同樣的生產(chǎn)條件,重復(fù)進(jìn)行1批次生產(chǎn),采集純化樣本33個(gè),用于模型的驗(yàn)證。丹酚酸B含量的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4。從圖4可以看出,剔除個(gè)別異常數(shù)據(jù)點(diǎn),純化過(guò)程的預(yù)測(cè)曲線與真實(shí)曲線呈現(xiàn)穩(wěn)定、一致的變化趨勢(shì),預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的平均相對(duì)誤差為4.8%。異常數(shù)據(jù)點(diǎn)的形成可能有如下幾個(gè)原因:首先近紅外儀器要求待測(cè)組分含量不能低于0.1%,目標(biāo)組分的含量過(guò)低會(huì)給檢測(cè)帶來(lái)較大誤差;同時(shí),考慮到本研究采用在線采譜的方式,液體在管路中一直是處于不斷運(yùn)動(dòng)的狀態(tài),其通過(guò)流通池時(shí)的流動(dòng)穩(wěn)定性以及氣泡問(wèn)題,會(huì)導(dǎo)致部分?jǐn)?shù)據(jù)失真,增大了預(yù)測(cè)誤差。4基于光譜預(yù)處理方法的預(yù)測(cè)模型建立近紅外光譜分析技術(shù)具有方便、省時(shí)、成本低、環(huán)境良好等優(yōu)點(diǎn)。本研究以產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的丹酚酸B純化過(guò)程作為研究對(duì)象,采用直接在生產(chǎn)裝置上進(jìn)行在線采譜的方式,建立了丹酚酸B含量檢測(cè)模型,模型的趨勢(shì)預(yù)測(cè)效果良好,能夠滿足生產(chǎn)過(guò)程