基于近紅外光譜技術(shù)的丹酚酸b含量檢測模型的建立

基于近紅外光譜技術(shù)的丹酚酸b含量檢測模型的建立

中國目前的中藥生產(chǎn)工藝控制模式很少考慮過程中組件和含量的變化，這基本上是基于傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)控制方法。同時(shí)，產(chǎn)品的在線檢測方法不能滿足生產(chǎn)過程中在線檢測的需要。實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程的在線實(shí)時(shí)質(zhì)量監(jiān)控是保證中藥質(zhì)量穩(wěn)定、均一的關(guān)鍵,也是實(shí)現(xiàn)中藥生產(chǎn)現(xiàn)代化的技術(shù)瓶頸。近紅外光譜(nearinfrared,NIR)是近年來迅速發(fā)展的一種快速分析技術(shù),它是被測樣品的物質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)信息的間接體現(xiàn)。樣品NIR光譜的獲取操作簡便且成本低,無須復(fù)雜的樣品前處理,符合在線檢測的要求。隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,NIR技術(shù)在農(nóng)業(yè)和石油工業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。2002年,美國FDA把該項(xiàng)技術(shù)作為一種標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法,2005版《中國藥典》已將“近紅外分光光度法指導(dǎo)原則”列入目錄。近年來,NIR技術(shù)在中藥行業(yè)特別是中藥生產(chǎn)過程的在線檢測逐漸成為研究熱點(diǎn),有學(xué)者應(yīng)用其檢測丹參水提過程丹參酮和丹酚酸B的含量,也有對梔子藥材提取和三七總皂苷模擬物系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析,最近還有應(yīng)用NIR技術(shù)對黃連和枳殼提取物的純化過程進(jìn)行快速分析的報(bào)道,但這些僅局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的模擬生產(chǎn)研究,基于生產(chǎn)規(guī)模的中藥純化過程的近紅外在線檢測技術(shù)的研究還未見報(bào)道。本研究以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)丹酚酸B的關(guān)鍵工序—純化過程作為研究系統(tǒng),以洗脫液中的主要有效成分-丹酚酸B的含量變化作為研究對象,利用NIR在線檢測技術(shù)采集光譜,并結(jié)合HPLC檢測技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)的數(shù)據(jù)處理方法,建立純化過程的丹酚酸B含量檢測模型,實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程的全程實(shí)時(shí)質(zhì)量監(jiān)控。1設(shè)備和材料1.1tqanalyst分析軟件傅立葉近紅外分析儀(美國Thermo公司),配有光纖配件及TQAnalyst分析軟件;Agilent1100高效液相色譜儀(美國HP公司);150L不銹鋼層析裝置(天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司)。1.2藥品、試劑與標(biāo)準(zhǔn)丹參(陜西商洛),經(jīng)天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司質(zhì)檢部鑒定為丹參SalviamiltiorrhizaBge;丹酚酸B對照品(中國藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈為色譜純(默克公司);甲酸為分析純(天津化學(xué)試劑有限公司)。2原則和方法2.1近紅外光譜特征信息近紅外光是介于可見光和中紅外光之間的電磁波,美國材料檢測學(xué)會(huì)將近紅外光譜區(qū)的范圍定義為780~2526nm(12820~3959cm-1),是人們最早發(fā)現(xiàn)的非可見光。它的光譜區(qū)與有機(jī)分子中含氫基團(tuán)(OH、NH、CH)振動(dòng)的合頻和各級倍頻的吸收區(qū)相一致,通過掃描樣品的近紅外光譜,可以得到樣品中有機(jī)分子含氫基團(tuán)的特征信息。不同基團(tuán)或同一基團(tuán)在不同化學(xué)環(huán)境中的近紅外吸收波長與強(qiáng)度都有明顯差別。因此近紅外光譜具有豐富的樣品結(jié)構(gòu)和組成信息,適用于天然產(chǎn)物活性成分的品質(zhì)檢測。由于近紅外光譜吸收譜帶較寬且重疊嚴(yán)重,必須使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取近紅外光譜特征信息。本研究以HPLC確定待測組分的含量,應(yīng)用偏最小二乘法(PLS)建立組分含量與NIR光譜間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型,實(shí)現(xiàn)對丹酚酸B生產(chǎn)過程的在線檢測和質(zhì)量監(jiān)控。2.2方法2.2.1藥渣聚酰胺樹脂純化稱取丹參藥材共50kg,置于500L提取罐中,加5.5倍量水,煎煮提取1h,放液;藥渣進(jìn)行第2次提取,加入3倍量水,煎煮提取0.5h,放液。提取液混合并經(jīng)過處理后,用聚酰胺樹脂純化,流速為1BV/H。在純化過程中每隔一定時(shí)間在線采譜1次,同時(shí)取樣進(jìn)行HPLC檢測。2.2.2麻黃苯磺酸鹽的光譜特性光譜采集方式:對純化過程每隔2~5min采譜1次,每次采集2張譜圖;采譜的同時(shí)取樣進(jìn)行HPLC檢測,樣品編號一一對應(yīng)。光譜采集條件:掃描范圍:10000~4000cm-1,掃描次數(shù)32,分辨率8cm-1。丹參洗脫液的近紅外譜圖參見圖1。在譜圖采集過程中,流通池中的樣品存在氣泡,一直是困擾試驗(yàn)進(jìn)行的大問題,因?yàn)槠渲苯佑绊懙焦庑盘栐诹魍ǔ刂械奈张c傳播,造成采集到的光譜出現(xiàn)不規(guī)則峰型,譜圖信息受到嚴(yán)重干擾。針對該問題,作者從設(shè)備、現(xiàn)場操作等方面入手,經(jīng)過試驗(yàn)和摸索,避免了氣泡的干擾現(xiàn)象,掃清了在線采譜的最大障礙。2.2.3對照品溶液的制備色譜條件:色譜柱為AgilentZORBAXSB-C18(5μm,4.6mm×250mm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-甲酸-水=30∶10∶1∶59;檢測波長286nm;流速1ml/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量5μl。對照品溶液的制備:精密稱取丹酚酸B對照品適量,加75%甲醇制成濃度約為0.14mg/ml的溶液。供試品溶液的制備:精密量取適量洗脫液,用75%甲醇稀釋至10ml,搖勻,用0.45μm濾膜過濾,取濾液即得。3結(jié)果3.1方法的對比實(shí)驗(yàn)在近紅外光譜的采集過程中,環(huán)境的變化會(huì)引起光譜的基線偏移,隨機(jī)噪聲和樣品背景干擾都會(huì)對校正結(jié)果產(chǎn)生影響,因此需要對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。本研究將各種光譜預(yù)處理方法排列組合,考察其對純化模型相關(guān)系數(shù)(r)、均方差(RMSEC)及內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)的影響。結(jié)果見表1。使用的預(yù)處理方法有多元散射校正(MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正交變換(SNV)、一階微分(FD)、二階微分(SD)、savitzky-gdcey濾波平滑(S-G)和Norris導(dǎo)數(shù)濾波平滑(Norris)等。根據(jù)表中的計(jì)算結(jié)果,最終選擇FD+Norris的光譜預(yù)處理方式建立模型。3.2模型的交叉驗(yàn)證采用PLS法建立定量模型時(shí),為避免出現(xiàn)“過擬合”現(xiàn)象,需要對主因子數(shù)進(jìn)行合理選擇。本研究采用留一交叉驗(yàn)證法,考察了主因子數(shù)對內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)的影響。模型的交叉驗(yàn)證結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出,當(dāng)主因子數(shù)為6時(shí),RMSECV為4.42,超過此主因子數(shù)時(shí),RMSECV不下降反而有所上升,因此確定最佳主因子數(shù)為6。3.3最佳算法的選擇光譜范圍的選擇在NIR定量分析模型的建立中是最難的一步。迄今為止,化學(xué)計(jì)量學(xué)領(lǐng)域還沒有一個(gè)完美的算法來選擇最佳的光譜范圍。本研究在去除吸收飽和波段及噪聲較大的部分波段后,通過比較,選取吸收特征較為明顯的9815~5430cm-1波段作為建立模型的最佳光譜范圍,模型的相關(guān)系數(shù)及預(yù)測效果良好。3.4丹酚酸b含量的pls建模本研究對6批次丹酚酸B純化過程的251個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用一階微分光譜對丹酚酸B含量進(jìn)行PLS建模。根據(jù)交叉驗(yàn)證獲得的結(jié)果如下:最佳主因子數(shù)為6,相關(guān)系數(shù)R=0.9776,RMSEC=4.02。模型預(yù)測值與真實(shí)值的相關(guān)系數(shù)圖見圖3。3.5異常數(shù)據(jù)點(diǎn)的純化為了驗(yàn)證上述模型的預(yù)測效果,參照同樣的生產(chǎn)條件,重復(fù)進(jìn)行1批次生產(chǎn),采集純化樣本33個(gè),用于模型的驗(yàn)證。丹酚酸B含量的預(yù)測值與真實(shí)值的變化趨勢見圖4。從圖4可以看出,剔除個(gè)別異常數(shù)據(jù)點(diǎn),純化過程的預(yù)測曲線與真實(shí)曲線呈現(xiàn)穩(wěn)定、一致的變化趨勢,預(yù)測值與真實(shí)值之間的平均相對誤差為4.8%。異常數(shù)據(jù)點(diǎn)的形成可能有如下幾個(gè)原因:首先近紅外儀器要求待測組分含量不能低于0.1%,目標(biāo)組分的含量過低會(huì)給檢測帶來較大誤差;同時(shí),考慮到本研究采用在線采譜的方式,液體在管路中一直是處于不斷運(yùn)動(dòng)的狀態(tài),其通過流通池時(shí)的流動(dòng)穩(wěn)定性以及氣泡問題,會(huì)導(dǎo)致部分?jǐn)?shù)據(jù)失真,增大了預(yù)測誤差。4基于光譜預(yù)處理方法的預(yù)測模型建立近紅外光譜分析技術(shù)具有方便、省時(shí)、成本低、環(huán)境良好等優(yōu)點(diǎn)。本研究以產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的丹酚酸B純化過程作為研究對象,采用直接在生產(chǎn)裝置上進(jìn)行在線采譜的方式,建立了丹酚酸B含量檢測模型,模型的趨勢預(yù)測效果良好,能夠滿足生產(chǎn)過程