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文檔簡介
第3章
蛋白質(zhì)的通性、純化和表征主要內(nèi)容蛋白質(zhì)的性質(zhì)
酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)(蛋白質(zhì)的沉淀)蛋白質(zhì)分離純化
一般原則分離純化方法*****
含量測定與純度鑒定一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。酸堿性質(zhì)主要決定于肽鏈上可解離的R基團(tuán)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)電荷性質(zhì)的判斷等電點(diǎn)時溶解度最小蛋白質(zhì)的等離子點(diǎn):在無鹽類干擾情況下,一種蛋白質(zhì)的質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH是它的真正等電點(diǎn),稱為等離子點(diǎn)。它是蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀1.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子大小屬于膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍。蛋白質(zhì)溶液是一種親水膠體。有水化層、雙電層——膠體系統(tǒng)相當(dāng)穩(wěn)定。具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動、不能通過半透膜。2.蛋白質(zhì)的沉淀鹽析法:中性鹽(硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉)—水化層不變性,除鹽后可溶解。有機(jī)溶劑沉淀法:極性有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇、丙酮)—水化層、降低介電常數(shù)低溫下快速操作可減慢變性速度。重金屬鹽沉淀法:重金屬(Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag2+)—與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)形成不溶性鹽誤服重金屬鹽:服用大量的牛乳或豆?jié){,再服用催吐劑排出體外??墒沟鞍踪|(zhì)變性。生物堿試劑和某些酸類沉淀法:生物堿:鞣酸、苦味酸、鎢酸、碘化鉀酸類:三氯醋酸、磺基水楊酸、硝酸pH<pI,蛋白質(zhì)帶正電荷,與其生成沉淀。加熱變性沉淀法:使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體,疏水基外露,破壞水化層和雙電層。三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo):增加蛋白制品的純度或比活力,以增加單位蛋白質(zhì)質(zhì)量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性(以活性蛋白/毫克蛋白表示),并希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。分離純化蛋白質(zhì)的一般程序前處理粗分級分離細(xì)分級分離結(jié)晶四、蛋白質(zhì)的分離純化方法透析和超過濾鹽溶和鹽析有機(jī)溶劑分級分離法超速離心層析(色譜)
(chromatography)***電泳
(electrophoresis)***1透析和超過濾
P33-34鹽溶:中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度。
蛋白質(zhì)吸附鹽離子后帶電彼此排斥,且與水作用增強(qiáng)。二價離子比一價離子的影響力大。鹽析:使蛋白質(zhì)沉淀。
水的活度降低,自由水變成鹽離子的水化水,蛋白質(zhì)的疏水表面暴露。去鹽后能再溶解。
2鹽溶和鹽析甲醇、乙醇和丙酮(與水互溶):
使蛋白質(zhì)沉淀,變性。使水溶液的介電常數(shù)降低,蛋白質(zhì)的離子化程度減弱,水化程度降低;與蛋白質(zhì)直接爭奪水化水。冷卻到-40℃至-60℃,不斷攪拌下加入。聚乙二醇:
水溶性非離子聚合物,脫去蛋白質(zhì)的水化層。聚乙二醇與蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)發(fā)生相互作用并在空間上阻礙蛋白質(zhì)與水相接近。3有機(jī)溶劑分級分離法4超速離心
P40沉降速度法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量沉降速度法沉降系數(shù)(s):單位離心場強(qiáng)度的沉降速度。沉降速率:把蛋白質(zhì)樣品溶液放在離心機(jī)內(nèi)的特制離心池中,在離心場的作用下,蛋白質(zhì)分子將沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向(徑向)移動,并產(chǎn)生沉降界面,界面的移動速度代表蛋白質(zhì)的沉降速率。一種蛋白質(zhì)分子在單位離心力場里的沉降速度為恒定值。沉降系數(shù)單位(S):10-13秒作為一個單位。S常用來近似地描述生物大分子的大小。蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒的沉降系數(shù)介于1×10-13到200×10-13秒的范圍。5.1基本原理:層析由流動相和固定相組成樣品作為流動相流過固定相各組分在兩相中分布程度不同各成分遷移率不同分離5層析(色譜)(Chromatography)
P26-27兩相:固定相(靜相)和流動相(動相)有效分配系數(shù):5.2層析的分類按流動相:氣相、液相色譜等;按操作形式不同:紙層析、薄層層析、柱層析等;按分離機(jī)制:凝膠層析、離子交換層析、親和層析、吸附層析等。5.2.1紙層析
(Filter-paperchromatography)相對遷移率
P275.2.2薄層層析
(Thin-layerchromatography)
P285.2.3柱層析
P27①凝膠過濾層析
(分子排阻層析、分子篩層析)
(Gel-filtrationchromatography)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離純化蛋白質(zhì)的一種方法。
P33介質(zhì):凝膠顆粒(多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu))交聯(lián)度或孔度(網(wǎng)孔大?。z的分級分離范圍交聯(lián)葡聚糖——SephadexG-50(1500-30000)瓊脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺——Bio-GelP原理:②離子交換層析
(Ion-exchangechromatography)根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。介質(zhì):離子交換樹脂溶液中的離子與樹脂上的帶電基團(tuán)進(jìn)行交換反應(yīng);各種離子交換能力不同,與樹脂結(jié)合的牢固程度就不同;在洗脫過程中,各種離子遷移率不同,達(dá)到分離的目的。
P37茚三酮反應(yīng):生成紫色物質(zhì)
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