第八章 核酸化學(xué)與代謝1課件

111111微生物生理生化胡小兵市政工程專業(yè)建筑工程學(xué)院二0一五年七月111111微生物生理生化2第八章、核酸化學(xué)二、核酸的組成成分三、DNA的結(jié)構(gòu)四、DNA和基因組五、RNA的結(jié)構(gòu)六、核酸生物合成一、核酸的生物學(xué)功能七、核酸的分子生物學(xué)2第八章、核酸化學(xué)二、核酸的組成成分三、DNA的結(jié)構(gòu)四、DN問題DNA分子有幾級結(jié)構(gòu)，細菌的DNA的結(jié)構(gòu)如何？基因與基因組有和區(qū)別？遺傳中發(fā)生點突變的依據(jù)是什么？生物遺傳中發(fā)生了“差錯”，這是好事還是壞事？細菌的DNA重組主要的方式有哪些？對于難降解的有機物如何篩選與培養(yǎng)特效菌種？分子生物學(xué)技術(shù)在水處理中有何作用？3問題DNA分子有幾級結(jié)構(gòu)，細菌的DNA的結(jié)構(gòu)如何？34一、核酸的生物學(xué)功能（一）核酸與遺傳信息的傳遞DNA是基本遺傳物質(zhì)RNA在傳遞遺傳信息上的作用

1)mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板；2)tRNA識別mRNA上的遺傳密碼，轉(zhuǎn)運特定氨基酸到核糖體上合成肽鏈；3)rRNA是核糖體的主要成分，是翻譯工作的場所。（二）核酸與蛋白質(zhì)的生物合成DNA有選擇地轉(zhuǎn)錄為mRNA，tRNA、rRNA也是DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。4一、核酸的生物學(xué)功能（一）核酸與遺傳信息的傳遞DNA是基本5生物遺傳的變異起源于DNA堿基配對的改變。１）由于DNA堿基的顛倒（如TA被顛倒為AT）或被調(diào)換（如GC被換為TA）；２）由于在DNA復(fù)制過程中被遺漏了一對或多了一對核苷酸；３）或者在轉(zhuǎn)譯時發(fā)生了差誤，如氨酰tRNA合成酶錯將一個結(jié)構(gòu)與正常氨基酸十分相似的物質(zhì)交給tRNA。４）還有一些生物的遺傳性狀發(fā)生了突變。（三）核酸結(jié)構(gòu)改變與生物變異變異和進化都是DNA結(jié)構(gòu)改變而引起蛋白質(zhì)改變結(jié)果。5生物遺傳的變異起源于DNA堿基配對的改變。（三）核酸結(jié)6（四）遺傳工程遺傳工程是用人工方法改組DNA，從而培育新型生物品種的技術(shù)。實驗室中將細菌作材料研究遺傳工程過程可分為：（1）重組DNA分子（基因重組）；（2）將重組DNA引入受體細胞（轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)）。（五）克隆與克隆化由單一親代細胞用無性繁殖產(chǎn)生的子代細胞稱克隆，形成克隆的過程稱克隆化。6（四）遺傳工程遺傳工程是用人工方法改組DNA，從而培育二、核酸的組成成分核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤堿purinebase

或嘧啶堿pyrimidinebase（堿基base）核糖ribose

或脫氧核糖deoxyribose

（戊糖amylsugar）二、核酸的組成成分核酸nucleicacid核苷酸nu（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脫氧核糖O核糖+H+糠醛甲基間苯二酚FeCl3綠色產(chǎn)物Δ脫氧核糖+H+

Δω-羥基-γ-酮戊醛二苯胺藍色產(chǎn)物RNA和DNA定性、定量測定（一）核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2C（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤guanine（G）（二）嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH1234NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶C（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHH9腺嘌呤腺苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）NH2（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸苷PO--O—O‖胸苷-5′-磷酸AMPP

O--O—O‖~ADPATPP

O--O—O‖~（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核OHO-O

O—CH2

TO=P—O-3′5′OHOHO-O

O—CH2

GO=P—O-3′5′OHO

O—CH2OHOH

AO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTAOHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHOHO-141、各種核苷三磷酸、脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA

和DNA合成的直接原料。2、能量代謝中的能量直接載體。ATP——能量“貨幣”UTP——參加糖的互相轉(zhuǎn)化與合成CTP——參加磷脂的合成GTP——參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成核苷酸作用141、各種核苷三磷酸、脫氧核苷三磷酸是體內(nèi)合成RNA2三、DNA的結(jié)構(gòu)（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)

1)DNA序列常被認為是堿基序列（basesequence)。2)通常堿基序列由DNA鏈的5′→3′方向?qū)憽?)DNA中有4種類型的核苷酸，有n個核苷酸組成的DNA鏈中可能有的不同序列總數(shù)為4n。三、DNA的結(jié)構(gòu)（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)1)DNA序列常16（二）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)16（二）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)17鳥嘌呤－胞嘧啶堿基對腺嘌呤－胸腺嘧啶堿基對17鳥嘌呤－胞嘧啶堿基對腺嘌呤－胸腺嘧啶堿基對18磷酸二酯鍵18磷酸二酯鍵192.雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（1）兩條多核苷酸鏈反向平行。（2）堿基內(nèi)側(cè)，A與T、G與C配對，分別形成3和2個氫鍵。（3）雙螺旋每轉(zhuǎn)一周有10個bp，螺距3.4nm，直徑2nm。3.雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素（1）氫鍵（太弱）；（2）堿基堆積力（basestackingforce，由芳香族堿基π電子間的相互作用引起的，能形成疏水核心，是穩(wěn)定DNA最重要的因素；（3）離子鍵（減少雙鏈間的靜電斥力）。192.雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（1）兩條多核苷酸鏈反向平行。202021212222染色體包裝的結(jié)構(gòu)模型多級螺旋模型壓縮倍數(shù)76405

DNA→核小體→螺線管→超螺線管→染色單體2nm10nm30(10)nm400nm2~10μm

一級包裝二級包裝三級包裝四級包裝（三）DNA的三級結(jié)構(gòu)線形分子、雙鏈環(huán)狀(dcDNA)→超螺旋染色體包裝的結(jié)構(gòu)模型多級螺旋模型（三）DNA的三級結(jié)構(gòu)線形分四、DNA與基因組織DNATranscription

RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能單位。結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因基因組四、DNA與基因組織DNATranscription25五、RNA結(jié)構(gòu)25五、262627主要特征：1.四臂四環(huán)；2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有結(jié)構(gòu)；3.D環(huán)上有二氫尿嘧啶(D)；4.反密碼環(huán)上的反密碼子與mRNA相互作用；5.可變環(huán)上的核苷酸數(shù)目可以變動；6.TψC環(huán)含有T和ψ；7.含有修飾堿基和不變核苷酸。27主要特征：2828291、原核微生物的單鏈環(huán)狀DNA主要采用滾環(huán)式復(fù)制一）DNA的生物合成-半保留DNA復(fù)制的起點和方向5′3′5′3′5′六核酸的生物合成291、原核微生物的單鏈環(huán)狀DNA主要采用滾環(huán)式復(fù)制一）DN302、真核生物DNA的多起點復(fù)制Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓn302、真核生物DNA的多起點復(fù)制Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓn31二）原核細胞的DNA復(fù)制1.DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）（dNMP）n+dNTPMg2+（dNMP）n+1+PPi特點（1）不能催化從無到有的聚合反應(yīng)。（2）催化的反應(yīng)只能在引物的3′延伸。（3）3′接上的核苷酸決定于模板鏈。（4）具有5′→3′和3′→5′外切酶活性。31二）原核細胞的DNA復(fù)制1.DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ322.PolⅡ和PolⅢPCR（多聚酶鏈式反應(yīng)）5′5′1熱變性2退火5′5′5′5′3DNA聚合酶5′5′5′5′重復(fù)1，2，3PCR反應(yīng)全過程322.PolⅡ和PolⅢ333.雙鏈DNA復(fù)制的分子機制（1）岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′復(fù)制叉上DNA合成的三種可行性333.雙鏈DNA復(fù)制的分子機制（1）岡崎片段和半不連續(xù)34（2）岡崎片段的RNA引物利福酶素對RNA聚合酶有抑制作用。氯霉素對蛋白質(zhì)合成有抑制作用。引物RNA在復(fù)制過程中暫時存在，最后通過PolⅠ的5′→3′外切酶活力水解。（3）DNA連接酶催化一條DNA鏈的3′末端與相鄰的另一條DNA鏈的5′末端之間的磷酸二酯鍵的合成。34（2）岡崎片段的RNA引物利福酶素對RNA聚合酶有抑制作35

其它功能：（1）修補雙螺旋DNA中單股的缺口；（2）連接線狀雙螺旋DNA以產(chǎn)生環(huán)狀DNA；（3）重組過程中將幾段DNA鏈連接起來。（4）母本DNA雙鏈的分離DNA解螺旋酶（DNAhelicase）拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（typeⅡtopoisomerase）35其它功能：（4）母本DNA雙鏈的分離DNA36（5）DNA聚合酶的“校對”作用DNA聚合酶的3′→5′外切酶活力是校對新生DNA鏈和改正聚合酶活性所造成“錯配”的一種手段。4.真核細胞DNA的復(fù)制（1）真核細胞DNA復(fù)制有多個起始點。（2）至少有5種DNA聚合酶，即α、β、γ、δ、ε。（3）端粒由端粒酶催化復(fù)制。生物細胞DNA復(fù)制分子機制的基本特點。36（5）DNA聚合酶的“校對”作用DNA聚375.反轉(zhuǎn)錄作用利用反轉(zhuǎn)錄酶可制造與任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的互補DNA（cDNA）。6.DNA的損傷與修復(fù)（1）DNA損傷的各種結(jié)構(gòu)變化①堿基缺失或插入②堿基改變③形成TT二聚體（2）修復(fù)機制①光復(fù)活；②切除修復(fù)；③重組修復(fù)；④SOS修復(fù)375.反轉(zhuǎn)錄作用利用反轉(zhuǎn)錄酶可制造與任何R387.重組修復(fù)5′5′重組修復(fù)5′三位科學(xué)家TomasLindahl、PaulModrich和AzizSancar因“DNA修復(fù)的機制研究”獲2015年諾貝爾化學(xué)獎。387.重組修復(fù)5′5′重組修復(fù)5′三位科學(xué)家To39391）細菌的轉(zhuǎn)化39391）細菌的轉(zhuǎn)化404041412）細菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)41412）細菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)423）

細菌的結(jié)合423）438.細菌的限制—修飾系統(tǒng)限制性核酸內(nèi)切酶5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—TA—A—C—3′3′—C—A—AT—T—G—5′平頭末端HpaⅠ5′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—G—T—TA—A—C—5′3′—GA—A—T—T—C—3′粘性末端EcoRⅠ438.細菌的限制—修飾系統(tǒng)限制性核酸內(nèi)切酶5′—G—T44二RNA的生物合成（一）轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有mRNA、tRNA、rRNA。1.原核細胞的轉(zhuǎn)錄E.coli的RNA聚合酶中，α2ββ′稱為核心酶。σ因子辨認模板DNA的起始位點。44二RNA的生物合成（一）轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有mRNA、t452.真核細胞的轉(zhuǎn)錄真核細胞RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類。3.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工（1）rRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工原核細胞30S前體17S25S16S23S5S真核細胞45S前體18S28S5.8S（2）tRNA前體的加工（3）真核細胞mRNA的加工452.真核細胞的轉(zhuǎn)錄真核細胞RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三468、DNA的分子生物學(xué)技術(shù)(后面我來講）方法應(yīng)用局限性變形梯度凝膠電泳(DGGE)利用基因序列和長度差異分析群落多樣性，適于分析較多種微生物條帶序列較短，靈敏度有限，不能定量末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T–RFLP)利用限制性位點差異分析群落多樣性，快速，半定量分析限制性酶切不完全；高效高通量需要多次反復(fù)酶切克隆文庫(Cloninglibrary)利用序列差異和測序可知群落中各種群系統(tǒng)分類；為新引物和探針設(shè)計提供信息克隆步驟耗時較長,

不適合大量分析,不適合反應(yīng)器監(jiān)測熒光原位雜交(FISH)原位定量和識別特定菌群背景熒光會干擾檢測，探針的穿透性差會造成假陰性實時熒光定量PCR(QRT-PCR)目標基因的擴增和定量分析不適合各種基因的快速同時分析；PCR高靈敏度易造成污染基因芯片(Microarray)高通量快速檢測群落多樣性，鑒定微生物并明確其生態(tài)作用環(huán)境樣品特異性和靈敏度低，不能定量，樣品處理復(fù)雜，儀器貴重468、DNA的分子生物學(xué)技術(shù)(后面我來講）方法應(yīng)用局限性變47變形梯度凝膠電泳微生物群落遺傳多樣性以及PCR擴增DNA片段的多態(tài)性。變性劑梯度

低

高PCR等長DNA產(chǎn)物1234567聚丙烯酰胺凝膠到達變性梯度時DAN解鏈，速度下降A(chǔ)BCDEFG47變形梯度凝膠電泳微生物群落遺傳多樣性以及PCR48DGGE技術(shù)主要操作過程如下:樣品預(yù)處理;

樣品DNA(或RNA)提取及純化;16SrDNA或基因片段的PCR擴增;預(yù)實驗(DGGE條件優(yōu)化);

制膠;樣品的DGGE分析;圖譜分析;條帶序列分析。48DGGE技術(shù)主要操作過程如下:樣品預(yù)處理;49DGGE過程示意圖49DGGE過程示意圖50DGGE特點：DGGE技術(shù)快速簡便、分離效果好。從理論上講，只要選擇的電泳條件如變性劑梯度、電泳時間、電壓等足夠精細，DGGE技術(shù)對于DNA片段的分辨率可以達到一個堿基差異水平，DGGE法只能對微生物群落中數(shù)量上大于1%的優(yōu)勢種群進行分析。DGGE技術(shù)無法提供代謝活性、細菌數(shù)量和基因表達水平方面的信息。50DGGE特點：DGGE技術(shù)快速簡便、分離效果好。從理論51應(yīng)用舉例：----變形梯度凝膠電泳（DGGE）分析生化反應(yīng)器微生物51應(yīng)用舉例：一、取樣與預(yù)處理1、微生物取樣

穩(wěn)定運行條件下，不同溫度條件(1)生物強化一體化反應(yīng)器的填料上生物膜(2)生物濾塔填料上生物膜。52一、取樣與預(yù)處理1、微生物取樣52532、樣品預(yù)處理----土壤基因組提取試劑盒快速提取生物膜中的總DNA具體操作如下：1）取0.1-0.3g污泥（生物膜）樣本，加入1mlBufferSW，渦旋振蕩1-3min（讓管底的污泥土壤振動起來），12000rpm離心1min，倒去上清液；2）加入750μl70%乙醇，渦旋振蕩1min，12000rpm離心1min，倒去上清液；并用移液槍吸盡余液；3）在污泥中加入500μlBufferSL，渦旋振蕩1-3min，65℃水浴20min，每隔5min渦旋振蕩5秒；4）12000rpm離心3min，上清液移至1.5ml離心管中；上清液中加等體積BufferSGL，顛倒混勻15-20次，冰上放置5min，室溫12000rpm離心5min；5)上清液轉(zhuǎn)入SpincolumnDM微試管中（管內(nèi)先放1個2mlcollectiontube），12000rpm離心1min，棄廢液，將2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微試管；532、樣品預(yù)處理----土壤基因組提取試劑5454556)向SpincolumnDM加入500μlBufferGWS，12000rpm離心1min，棄

廢液，將2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微試管；7)向SpincolumnDM中加入700μlBufferGW1，12000rpm離心1min棄廢液，2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微試管；8)向SpincolumnDM中加入500μlBufferGW2，12000rpm離心1min棄廢液，2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微試管；9)將2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微試管中，最大轉(zhuǎn)速離心2min，將SpincolumnDM管中上清液轉(zhuǎn)到1.5ml離心管中，打開蓋子，室溫放置數(shù)分數(shù)以充分晾干；10)再加入5-100μlBufferGE，12000rpm離心1min，把離心管中的液體重新加到原來的SpincolumnDM管中。室溫放置1min，12000rpm離心1min，液體離心管中溶液（DAN樣品）放置冰箱-20℃保存。556)向SpincolumnDM加入500μlB563、DNA提出物分離與鑒別

1)稱瓊脂糖210ml，加入TBE緩沖液30ml，80℃微波溶化，加入2.0μlgoldview新型核酸染料上膠到電泳槽上。2)把分離的總DNA樣品加入到瓊脂糖電泳凝膠上，同時點入markerλDNA/HindⅢ。3)電流條件：U=97V，I=61-63mA，電泳時間為1h30min到1h50min。4)然后把DNA分離后的凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)中觀察DAN分離效果，并拍攝圖像。563、DNA提出物分離與鑒別5757二、總DNA提取58Marker58Marker23130bp9416bp6559bp2322bp2927bp二、總DNA提取58Marker58Marker591、反應(yīng)體系：試劑50ul體系終濃度Fowardprimer（F468）2ul0.4uMReverseprimer（R468）2ul0.4uM2×2TaqMasterMix25ul1×TemplateDNA﹤1ug﹤1ug/reactionRNase-freeWaterUpto50ul三、PCR擴增591、反應(yīng)體系：試劑50ul體系終濃度Fowardpri6060引物序列Primer名稱序列(5'to3')堿基數(shù)細菌通用引物F468CGC

CCG

GGG

CGC

GCC

CCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGACTCCTACGGGAGGCAG56細菌通用引物R468GACTACCAGGGTATCTAATCC216060引物序列Primer名稱序列(5'to3')堿基數(shù)細61步驟溫度時間預(yù)變性94℃2min變性94℃30s退火55-65℃30s延伸72℃30s終延伸72℃2min變性—延伸，25-35個循環(huán)；2、PCR反應(yīng)條件：61步驟溫度時間預(yù)變性94℃2min變性94℃30s退火55623、瓊脂糖電泳后紫外成像。Marker623、瓊脂糖電泳后紫外成像。Marker63四、DGGE分離63四、DGGE分離64DGGE分離具體過程：1）配制高（70%）、低（30%）濃度的變性瓊脂糖膠，加入聚合劑TEMED和DGGE染料。

2）用透明膠封固玻璃板兩頭，在距底板0.5-1.0mm的位置上放置梳子，將溫熱的瓊脂糖凝膠放架子上打入膠模中，排氣，凝膠厚度為3-5mm。3）在凝膠完全凝固后，撕去透明膠，小心地將玻璃板移至裝有1×TAE緩沖液的電泳槽中，輕輕拔去梳子，且使緩沖液沒過膠面約1mm。64DGGE分離具體過程：654）DNA樣品與10×Loading-buffer（含有溴酚藍和甘油等物質(zhì)）混合后，用微量取樣器慢慢將混合物加至樣品槽中。5）電泳條件：60°C、電泳電壓60V，電泳12h后，打開夾板，加入10%EB染料緩沖液中20min，取出夾板，清水沖洗2遍后，擦干放在凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并拍攝圖像。6）用潔凈刀片將條帶切下，放入1.5mlEP管，送測序公司純化測序。654）DNA樣品與10×Loading-buffer（含有66DGGE產(chǎn)物紫外呈像DGGE條帶切割后呈像66DGGE產(chǎn)物DGGE條帶切割后呈像五）測序過程（一）測序過程1、對回收的DGGE條帶進行二次PCR擴增及產(chǎn)物回收；

2、目的片斷TA克?。?、藍白斑篩選；4、質(zhì)粒提取；5、M13+/-測序。