春石斛新品種選育研究

春石斛新品種選育研究

春石斛是雅加羅西亞州的主要生產(chǎn)區(qū)和消費(fèi)國。日本園藝工作者經(jīng)過百余年的多代雜交選擇,培育出了大量的優(yōu)良品系,其花色艷麗,多密著于鱗莖,花期長(zhǎng),耐低溫性強(qiáng),可調(diào)節(jié)花期在春節(jié)上市,成為近年來年宵花市中的流行盆花。國內(nèi)也有人嘗試通過雜交育種培育新品種,及組織培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)繁。為了解決種苗依賴進(jìn)口的問題,作者從2002年開始,收集資源,進(jìn)行雜交選育新品種,并利用擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)技術(shù)構(gòu)建春石斛品種的DNA指紋圖譜,為品種鑒定、評(píng)價(jià)和品種創(chuàng)新,新品種保護(hù)提供可靠方便的技術(shù)手段。1材料和方法1.1從中國引進(jìn)品種的多樣性2002年從日本引進(jìn)8個(gè)春石斛品種;2003年從泰國引進(jìn)26個(gè)品種和72個(gè)雜交組合,從中國上海引進(jìn)7個(gè)品種,從中國臺(tái)灣引進(jìn)1個(gè)品種和4個(gè)雜交組合;2005年從中國廣州和中國上海引進(jìn)原生種18個(gè);2006年從中國深圳引進(jìn)優(yōu)良品種5個(gè)。通過組織培養(yǎng)培育成盆花,選出符合中國國情的品種和單株作為雜交育種材料。1.2性狀互補(bǔ)原則育種目標(biāo):抗性強(qiáng),早熟,著花率高,單花序花朵數(shù)3朵以上,花梗朝上,花瓣厚實(shí),花期長(zhǎng),中大花型和迷你型,分枝性好。根據(jù)性狀互補(bǔ)原則,按育種目標(biāo),以優(yōu)良性狀較多的個(gè)體為母本,與母本具有互補(bǔ)性狀的個(gè)體為父本進(jìn)行雜交。雜交獲得的果莢發(fā)育成熟后,將種子培養(yǎng)試管苗,測(cè)定成活率,并進(jìn)行性狀觀測(cè)。1.3pcr擴(kuò)增條件的確定從341個(gè)原生種、栽培品種和雜交育種獲得的雜交后代單株中,選出30個(gè)優(yōu)良單株(表1)進(jìn)行親緣關(guān)系的AFLP分析。采用改良的Doyle的方法提取DNA,在做選擇性擴(kuò)增時(shí),引物中加入了熒光內(nèi)標(biāo),電泳過程在ABI377測(cè)序儀上進(jìn)行。試驗(yàn)方法:取健康正常幼葉低溫干燥后,按十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法從試材鮮葉中提取基因組DNA,經(jīng)檢測(cè)后將DNA稀釋至200ng·μL-1備用,37℃保溫5h,8℃保存4h,4℃過夜;然后預(yù)擴(kuò)增,在0.2mL離心管中加入25μL反應(yīng)體系:模板DNA2μL,Pre-ampmix1μL,dNTPs1μL,10×PCRbuffer2.5μL,Taq酶0.5μL,蒸餾水18μL。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃變性2min,94℃變性30s,56℃復(fù)性30s,72℃延伸80s,72℃延伸5min;再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1∶20稀釋,作為選擇模板,在0.2mL離心管中加入25μL選擇性擴(kuò)增體系:預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品2μL,10×PCRbuffer2.5μL,dNTPs0.5μL,ECRI引物1μL,MseⅠ4種1μL,Taq酶0.5μL,蒸餾水17.5μL?；靹螂x心數(shù)秒,按下列參數(shù)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán):第1循環(huán)擴(kuò)增:94℃變性30s,65℃退火30s,72℃延伸80s;以后每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.7℃,其他不變,擴(kuò)增12個(gè)循環(huán);接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23個(gè)循環(huán):94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸80s;最后采用熒光AFLP電泳,電泳在ABI377測(cè)序儀進(jìn)行跑膠和AFLP多態(tài)性帶分析,通過測(cè)序儀上的數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),采用NTSYSpVersion2.10e統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,進(jìn)行一維聚類分析。2結(jié)果與分析2.1雜交前花的選擇由表2可以看出,異交成功率比自交成功率高。另外,2006年迷你型與大花型品種雜交的成功率較低。從雜交后代中選出5029號(hào)和5041號(hào)最符合育種目標(biāo)。5029號(hào):白花粉色楔角紫紅心,中花型,株高35cm,花期1月底,莖直徑1.1cm,著花率高,每花序花朵數(shù)為3朵。5041號(hào):紅花,紫唇,中大花型,株高35cm,花期1月底,莖直徑1.1cm,著花率高,每花序花朵數(shù)為3朵。2.2春石斛品種親屬關(guān)系的avlp分析2.2.1引用試劑篩選2.2.2ssr引物組合多態(tài)性圖1為應(yīng)用引物組合E-AAG/M-CAG對(duì)供試的30個(gè)春石斛品種進(jìn)行AFLP擴(kuò)增的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。該引物組合共擴(kuò)增出126個(gè)可分析位點(diǎn),其中多態(tài)性位點(diǎn)91個(gè),占72.2%。采用其他7個(gè)引物組合多態(tài)位點(diǎn)平均占70.6%?？梢?供試品種間在DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)組成上存在相當(dāng)大的差異,具有較高的遺傳多樣性,可作為AFLP技術(shù)鑒定品種的依據(jù)。如品種‘DeLLELegame’與‘SenLanNo.11’采用本引物組合只有3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),采用其他引物組合在DNA指紋圖譜上差異也很小,可見這2個(gè)品種具有很高的遺傳一致性,親緣關(guān)系很近;而‘SantanaAnary’與其他品種的遺傳距離最遠(yuǎn),多態(tài)性也較高,在該引物組合擴(kuò)增的指紋圖譜上共有23個(gè)多態(tài)性帶。2.2.3對(duì)春石斛品種的觀賞形態(tài)的影響應(yīng)用不加權(quán)配對(duì)組算術(shù)方法(UPGMA)進(jìn)行遺傳聚類(圖2),30個(gè)春石斛品種在0.62水平上分為2個(gè)大類,其中‘SakuraHime’品種和其他品種的遺傳距離最遠(yuǎn),在觀賞形態(tài)上該品種為淡黃色,無花眼、花心和楔角的分離,與其他春石斛品種也有明顯差異,從花色遺傳品質(zhì)上該品種更接近原生種,可單獨(dú)分為一類。其他品種在0.65水平上又可分為2類,5046,0274,5027,1401,‘SenlanNo.5’,5063,‘YellowTsuden’,5026,‘FairyFlaka’品種聚為一類,其他品種為另一類;再其次,在0.68,0.73和0.79遺傳距離水平上,又可分為不同的小類群。2.3.4aaneara酶活劑品種的制備通過30個(gè)品種花色特征(表1)和遺傳距離分析(圖2),可以看出,品種親緣關(guān)系與花色特征有一定的相關(guān)性,‘SantanaAnary’品種與其他品種花色特征差異最大,同時(shí)在遺傳距離上最遠(yuǎn),花色相近的品種往往比較容易聚成一類,但也不是絕對(duì)的,12號(hào)和13號(hào)品種在遺傳距離上非常相近,但花色特征有一定的差別,‘SenlanNo.15’和‘SenlanNo.16’品種是同一個(gè)品種的2個(gè)無性系突變,在遺傳距離上非常接近。品種株型和著花節(jié)位與品種的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近相關(guān)度較小。3春石斛aflp擴(kuò)增多態(tài)性作者對(duì)春石斛進(jìn)行多年的雜交育種,獲得了一定量的雜交品種,從中進(jìn)行優(yōu)良品種選育,其中,5029號(hào)和5041號(hào)最符合育種目標(biāo)。在春石斛的親緣關(guān)系的AFLP分析過程種中,采用熒光AFLP技術(shù),在做選擇性擴(kuò)增時(shí),引物中加入了熒光內(nèi)標(biāo),電泳過程在ABI377測(cè)序儀上進(jìn)行。這種電泳技術(shù)比普通的銀染電泳更加清晰,可區(qū)分的條帶更多,而且采用測(cè)序儀上的電腦程序,進(jìn)行多態(tài)性數(shù)據(jù)處理,精確度更高,且電泳中加入熒光內(nèi)標(biāo)更容易標(biāo)定DNA片段的分子質(zhì)量,進(jìn)行特異條帶的定位更為方便。特別是E-ACA/M-CTC引物組合擴(kuò)增的有效條帶和多態(tài)性條帶都很多,得到的DNA指紋圖譜也非常清晰,在DNA提取質(zhì)量得到保證的前提下,具有很高的穩(wěn)定性。采用熒光AFLP技術(shù)構(gòu)建春石斛新品種的DNA指紋圖,可為品種鑒定、評(píng)價(jià)和品種創(chuàng)新、新品種保護(hù)提供可靠方便的技術(shù)手段。建立AFLP分析體系后,以泳道序號(hào)H111-8,H113-2,RYG009,KWG011等品種作為試材篩選引物,以確認(rèn)合適的引物。從64對(duì)AFLP引物組合中篩選出8對(duì)多態(tài)性較高,帶型質(zhì)量較好,分辨率較高的引物。從表3可知,8對(duì)引物組合在30個(gè)春石斛品種中共在1102個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出條帶,平均每對(duì)引物擴(kuò)增位點(diǎn)137.8個(gè),擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)量最多的引物E