6%番茄紅素油樹脂重結(jié)晶法制備番茄紅素晶體

6%番茄紅素油樹脂重結(jié)晶法制備番茄紅素晶體

0番茄紅素抗氧化能力研究番茄紅素是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物，其結(jié)構(gòu)為cs0h56，樣品為174（反式）。它不溶于水、脂，也不溶于油脂。晶體呈紅色。由于其最早在番茄中發(fā)現(xiàn),故稱為番茄紅素。其分子結(jié)構(gòu)中有11個不飽和共軛雙鍵和兩個非共軛不飽和雙鍵,是目前發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力最強的類胡蘿卜素,在諸多抗氧化劑中番茄紅素猝滅單線態(tài)氧的能力最強。研究者認為,在人機體內(nèi),氧自由基與生物大分子反應(yīng)對體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物等重要物質(zhì)反應(yīng),將損害人機體功能,對人體健康造成威脅。番茄紅素及其他類胡蘿卜素可以保護機體內(nèi)大分子物質(zhì)避免受氧化傷害。因此,自20世紀(jì)50年代以來,其已經(jīng)成為功能性食品添加劑和抗腫瘤保健食品研究開發(fā)的熱點之一,并應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)。但是,高純度的番茄紅素較難取得,而且易于氧化,給研究者造成很大不便。美國Sigma等公司有標(biāo)準(zhǔn)品出售但價格昂貴;江南大學(xué)李偉曾經(jīng)報道制備出高純度番茄紅素,但未見形成商品。本研究用重結(jié)晶法制備出高純度番茄紅素晶體,操作簡便,為一般研究者取得高純度的番茄紅素提供了一條有效途徑。1實驗材料、方法和儀器1.1儀器、試藥與儀器6%番茄紅素油樹脂,華北制藥集團生產(chǎn);番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品,美國Sigma公司生產(chǎn);正己烷等有機溶劑及藥品均為分析純。高效液相色譜儀,美國WATERS公司生產(chǎn);Q10差示掃描量熱分析儀,美國TA公司生產(chǎn);UV-2100紫外分光光度計,產(chǎn)自北京;BrukerFT-IR紅外光譜儀,產(chǎn)自美國;OLYMPUS顯微鏡,產(chǎn)自日本;RE-52型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,產(chǎn)自上海博通;XMT-420自動控溫儀,北京朝陽自動化儀表廠生產(chǎn)。1.2實驗方法1.2.1高純度的番茄紅素晶體的制備參考李偉和邸進申的方法,利用番茄紅素在溶液中的溶解度隨溫度降低而下降的性質(zhì),采用降溫結(jié)晶的方法對番茄紅素進行純化。步驟如下:1)稱取一定量6%番茄紅素油樹脂,加適量BHT以防氧化,分散于適量正己烷中,加等體積的無水乙醇KOH飽和液,在氮氣保護下皂化后加適量蒸餾水除去水溶性物質(zhì),靜置分層并用正己烷回收水層中的番茄紅素,加適量蒸餾水洗上層溶液至中性;2)番茄紅素溶液經(jīng)無水Na2SO4脫水,真空揮去部分溶劑,冷卻析出晶體;3)濾出晶體溶于熱溶劑中達到飽和,勻速緩慢降溫析出晶體;4)多次重復(fù)得到高純度番茄紅素晶體;5)選取不同皂化條件和不同重結(jié)晶溶劑對高純度番茄紅素晶體得率影響進行單因素實驗,來確定最佳制備條件。皂化和重結(jié)晶等過程應(yīng)在避光與充氮氣條件下進行。番茄紅素晶體得率Z采用下式計算式中M1—番茄紅素晶體的質(zhì)量(g);C1—番茄紅素晶體的純度(%);M0—番茄紅素油樹脂的質(zhì)量(g);C0—油樹脂或重結(jié)晶母液中番茄紅素的含量(%)。1.2.2紅外光譜及番茄紅素純度將適量番茄紅素晶體溶于正己烷中,在350～550nm范圍內(nèi)掃描測定紫外吸收光譜。采取高效液相色譜法分析,用保留時間定性與單點校正法測純度。色譜條件:色譜柱為C18;柱溫為25℃;流動相為甲醇/乙腈/二氯甲烷(體積比44:44:12);流速為1mL/min;檢測器為二極管陣列檢測器;檢測波長為475nm;采用KBr壓片法測定紅外光譜。DSC法測定番茄紅素純度,檢測條件為:起始平衡溫度為120℃,終止溫度200℃,升溫速率為5℃/min。記錄樣品熔化曲線,用DSC純度分析軟件進行分析。2結(jié)果與分析2.1皂化時間對一級結(jié)晶晶體得率的影響番茄紅素油樹脂經(jīng)正己烷-無水乙醇KOH飽和液組成的體系皂化后,一級結(jié)晶的番茄紅素晶體得率按式(1)計算,純度用DSC法測定(下同)。不同溫度條件下皂化60min,一級結(jié)晶番茄紅素晶體得率及純度見圖1所示。由圖1可見,番茄紅素晶體得率隨皂化溫度提高呈下降趨勢。這是因為番茄紅素在高溫下氧化降解和發(fā)生異構(gòu)化而損失,而結(jié)晶純度卻與得率呈相反的變化趨勢。70℃條件下不同皂化時間的一級結(jié)晶晶體得率及純度如圖2所示。從圖2發(fā)現(xiàn),皂化30～50min后晶體得率變化不顯著,50～70min后得率明顯下降;相反,純度隨皂化時間增加顯著升高。番茄紅素油樹脂中除含番茄紅素外,還含有大量的油脂和類脂等脂溶性成分與膠類雜質(zhì)等雜質(zhì),采用皂化法去除原料中的脂質(zhì)等可皂化物,要求堿液與脂質(zhì)充分混合,以使脂類被徹底皂化除去。除了利用正己烷作脂類分散劑、無水乙醇作皂化助劑外,因番茄紅素在堿性條件下的性質(zhì)較穩(wěn)定,如果皂化反應(yīng)強度過大,番茄紅素發(fā)生氧化降解速度較快,會引起番茄紅素的損失,影響得率,因此可以添加適量的抗氧化劑BHT來減少番茄紅素的損失。而溫度較低或時間不足則皂化不徹底,會降低番茄紅素晶體的純度。也就是說,皂化反應(yīng)進行得越完全,脂類等雜質(zhì)去除得越徹底,所得晶體純度就越高。因為本實驗?zāi)康氖菫榱巳〉酶呒兌鹊姆鸭t素樣品,并且各反應(yīng)條件對應(yīng)的得率之間差異不大,實驗選定皂化條件在稍過量堿存在下溫度為70℃,時間為60min。70℃皂化一次結(jié)晶晶體得率為56.10%,純度達到94.53%。2.2重結(jié)晶溶劑對番茄紅素穩(wěn)定性的影響番茄紅素在溶劑中的穩(wěn)定性和溶解特性是選擇降溫重結(jié)晶溶劑的主要依據(jù),不同溶劑下二級結(jié)晶的晶體得率如圖3所示。由圖3可知,用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿和四氫呋喃作重結(jié)晶溶劑,所得晶體得率明顯不同。其中,正己烷、乙酸乙酯所得晶體的得率較高,分別是64.6%和65.4%,二氯甲烷所得晶體的得率還不足50%。這說明,番茄紅素在正己烷、乙酸乙酯中的穩(wěn)定性比另外3種溶劑高,與文獻的研究結(jié)果相吻合。由于番茄紅素在乙酸乙酯中的溶解度高于在正己烷中的溶解度,并且隨溫度升高呈現(xiàn)緩慢增加的變化,有利于重結(jié)晶,所以選取乙酸乙酯為重結(jié)晶溶劑。2.3同重結(jié)晶級數(shù)的純度和得率用乙酸乙酯作重結(jié)晶的溶劑,一級、二級與三級重結(jié)晶所得樣品用差示掃描量熱法和高效液相色譜單點校正法檢測純度,不同重結(jié)晶級數(shù)的純度和得率如表1所示。按DSC法測定的數(shù)據(jù)中,二級重結(jié)晶所得樣品比一級結(jié)晶的純度提高了4.86%,三級重結(jié)晶比二級結(jié)晶所得樣品的純度又提高了0.60%,達到了99.17%。但因番茄紅素氧化降解和異構(gòu)化是和結(jié)晶同時發(fā)生的,結(jié)晶時間越長、重結(jié)晶次數(shù)越多,番茄紅素的損失越大,得率越低。因此,本研究認為三級重結(jié)晶比較合適。2.4dsc純度分析番茄紅素紫外吸收掃描如圖4所示。由圖4可知,番茄紅素正己烷溶液在350～550nm范圍內(nèi),樣品在444nm,472nm,502nm處有較大吸收,且峰形、吸收強度與標(biāo)準(zhǔn)樣品的紫外吸收非常一致。番茄紅素樣品紅外光譜如圖5所示。由圖5可知,該樣品為典型的共扼多烯結(jié)構(gòu),其特征吸收與全反式番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)紅外吸收圖譜一致。其中,3038cm-1處的吸收峰為飽和C-H鍵的伸縮振動;1560cm-1處的峰是C=C伸縮振動吸收峰;959cm-1為反式單烯雙取代的CH=CH剪切振動吸收峰;在730～665cm-1內(nèi),沒有出現(xiàn)吸收峰,這一范圍是出現(xiàn)順式單烯雙取代的CH=CH剪切振動的吸收峰區(qū)域,說明晶體樣品中沒有順式結(jié)構(gòu)存在。經(jīng)HPLC檢測得出,樣品在11.32min出峰,與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間完全一致。用標(biāo)準(zhǔn)樣品作外標(biāo),采用單點校正法計算出樣品純度為104.03%。這說明,樣品為全反式番茄紅素,三級重結(jié)晶晶體的純度高于標(biāo)準(zhǔn)品純度。用顯微鏡觀察,番茄紅素單晶直徑大于100μm,晶體質(zhì)地均一色澤深紅透明。DSC法適用于小分子有機化合物的定性和純度測定,在精確度與準(zhǔn)確度上優(yōu)于UV,GC和HPLC法,且測定時間短,不需要標(biāo)準(zhǔn)品做對照。根據(jù)范特霍夫熔點下降理論,雜質(zhì)的摩爾分數(shù)與熔點下降量成正比關(guān)系。樣品純度越高,其熔融吸熱產(chǎn)生的DSC曲線峰形越尖銳。番茄紅素3次結(jié)晶的DSC曲線和純度分析結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,隨重結(jié)晶次數(shù)增加,樣品DSC曲線峰形逐漸尖銳。用DSC純度分析軟件分析,3次重結(jié)晶樣品純度分別為94.01%,98.58%,99.17%。用式(1)計算總得率為24.7%。DSC儀同時測出第3次重結(jié)晶樣品的熔融熱為118.9J/g,熔點為175.03℃。其熔點略高于174℃的文獻值,根據(jù)范特霍夫熔點下降理論判斷,樣品純度很高。3量熱法與熱法的重結(jié)晶法1)在堿稍過量、70℃條件下,皂化60min可以去除番茄紅素油樹脂原料中絕大部分脂質(zhì)等可皂化雜質(zhì),一級結(jié)晶晶體得率為56.1%。2)采用紫外掃描光譜、紅外光譜和高效液相色譜以及差示掃描量熱法對樣品定性與定量分析,其結(jié)果表明,所得樣品為全反式番茄紅素。3)用乙酸乙酯作重結(jié)晶溶劑,以6℃/h的速率緩慢降溫,重結(jié)晶過程中番茄紅素氧化降解和異構(gòu)化產(chǎn)物沒有隨全反式番茄紅