組織病理學(xué)切片石蠟切片和冰凍切片及頻域1471對大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的評價

組織病理學(xué)切片石蠟切片和冰凍切片及頻域1471對大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的評價

相干光刻度掃描（ob）是一種高度靈活的生物組織特征的微觀檢測系統(tǒng)，已經(jīng)提高了我們對眼底病的認(rèn)識。除臨床應(yīng)用外,在測量實驗動物活體視網(wǎng)膜厚度方面具有很好的作用。石蠟切片和冰凍切片均是組織病理學(xué)的常用方法,用以研究離體組織,可用于觀察和測量視網(wǎng)膜病變。石蠟切片具有組織保存良好、結(jié)構(gòu)清晰等優(yōu)點;冰凍切片制作方便快捷,且可以避免因脫水等處理造成的組織收縮。本研究采用三種不同的實驗方法來評價其在觀察大鼠視網(wǎng)膜各亞層組織結(jié)構(gòu)中的特點,及分析其異同,以指導(dǎo)實驗應(yīng)用。材料和方法一、實驗動物及設(shè)備12只SPF級健康成年雄性BrownNorway(BN)大鼠(北京維通利華實驗動物有限公司),體重220~250g,實驗前檢查大鼠眼前節(jié)及眼底均無異常。OCT檢查后處死動物,取左眼做石蠟切片,右眼做冰凍切片。二、視網(wǎng)膜掃描ro用復(fù)方托吡卡胺滴眼液對大鼠散瞳,10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射全身麻醉,應(yīng)用頻域OCT(CirrusHD-OCT,CarlZeiss公司)檢測12只大鼠(24眼)在距視盤2PD處視網(wǎng)膜。頻域OCT光源波長840nm,軸向分辨率5μm,橫向分辨率20μm,掃描深度2.0mm,選用HD5LineRaster掃描方式,每只眼獲取3張清晰圖片。用頻域OCT自帶軟件測量距視盤約2PD處視網(wǎng)膜及其各亞層厚度,包括內(nèi)界膜至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(retinalganglioncelllayer,RGCL)、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、外核層、外界膜至視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)層的厚度,每個測量點重復(fù)5次,取其平均值作為該亞層厚度。三、視網(wǎng)膜厚度檢測過量麻醉處死大鼠后立即摘除眼球。(1)取12只大鼠左眼制作石蠟切片:用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24小時后去除眼前節(jié)及玻璃體,常規(guī)石蠟包埋,采用石蠟切片機(jī)(LeicaRM2155,德國柏林)平行于角膜至視盤的矢狀位連續(xù)切片,厚度4μm,HE染色,中性樹脂封片,取通過視盤中央的切片,測量距離視盤約2PD的視網(wǎng)膜厚度。(2)取12只大鼠右眼制作冰凍切片:OCT(optimumcuttingtemperaturecompoundTissue-Tek,SakuraFinetekInc,日本東京)包埋,恒溫冷凍切片機(jī)(LeicaCM1900,德國柏林)快速冷凍,平行于角膜至視盤的矢狀位連續(xù)切片,厚度6μm,固定30s,HE染色,中性樹脂封片,取通過視盤中央的切片,測量距離視盤約2PD的視網(wǎng)膜厚度(圖1)。在200倍光鏡(Nikoneclipse50i)下對石蠟切片及冰凍切片進(jìn)行采圖后應(yīng)用ImageJ圖像分析系統(tǒng)測量視網(wǎng)膜上述各亞層及視網(wǎng)膜全層厚度,每層測量3次,取其平均值作為該層厚度。四、厚度的標(biāo)準(zhǔn)差表示應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,各方法所測厚度數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析并進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗,組間的多重比較采用LST-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果一、視網(wǎng)膜色素上皮質(zhì)頻域OCT對活體大鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜斷層掃描,可以分辨出內(nèi)界膜至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、外核層、外界膜至視網(wǎng)膜色素上皮層(圖2)。但是內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層之間的層次分辨不明顯,厚度小不易測量,其厚度記為內(nèi)界膜至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層;外界膜及視網(wǎng)膜色素上皮層厚度較小,不易測量,記為外界膜至視網(wǎng)膜色素上皮層。各厚度測量數(shù)值見表1。二、視網(wǎng)膜各亞層結(jié)構(gòu)比較兩種方法制作大鼠視網(wǎng)膜組織切片(圖2),鏡下觀察石蠟切片層次清晰,視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊,染色鮮艷,可以準(zhǔn)確分辨視網(wǎng)膜10層結(jié)構(gòu);而冰凍切片觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層不完整,其他層次清晰,細(xì)胞排列整齊。各層厚度測量數(shù)據(jù)見表1。三、組織病理切片和頻域OCT對大鼠視網(wǎng)膜研究的比較組織病理切片和頻域OCT均可用于大鼠視網(wǎng)膜的觀察,對大鼠視網(wǎng)膜各亞層進(jìn)行測量,結(jié)果顯示石蠟切片較冰凍切片和OCT圖像均有一定程度的收縮,其視網(wǎng)膜總厚度約為另兩者的80%,但是視網(wǎng)膜的各亞層收縮比例不同。石蠟切片所測大鼠距視盤2PD處視網(wǎng)膜厚度(166.98±9.07)μm,冰凍切片所測大鼠距視盤2PD處視網(wǎng)膜厚度(209.06±10.41)μm,頻域OCT測量值為(208.75±11.19)μm。在內(nèi)界膜至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、外界膜至色素上皮層以及視網(wǎng)膜全層,OCT圖像與冰凍切片測量結(jié)果接近,兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.126、0.063、0.425),而石蠟切片的厚度明顯比其他兩者小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。在內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層,三種方法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.240、0.138)。對于外叢狀層,冰凍切片和石蠟切片之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.590),而OCT圖像的測量值明顯比前兩者大,與前兩者的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。在外核層,OCT所得結(jié)果最大,冰凍切片其次,石蠟切片最小,三種方法兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)(表1、圖3)。實驗結(jié)果分析自1991年OCT問世以來,Huang等就發(fā)現(xiàn)OCT與組織學(xué)檢查具有一定的相關(guān)性。究竟OCT與組織學(xué)檢查的視網(wǎng)膜組織具有何種相關(guān)性,報道較少。我們采用三種不同的實驗方法,包括石蠟切片、冰凍切片及頻域OCT來評價其在測量大鼠視網(wǎng)膜厚度方面的異同。結(jié)果顯示,頻域OCT圖像與冰凍切片測量結(jié)果接近,而石蠟切片比冰凍切片及頻域OCT所測數(shù)據(jù)小,其視網(wǎng)膜總厚度約為另兩者的80%左右。2005年Sho等的研究表明OCT所測BN大鼠視網(wǎng)膜厚度與組織學(xué)測量結(jié)果具有相關(guān)性,且組織學(xué)所得結(jié)果比OCT所得視網(wǎng)膜厚度薄9.5%~18.5%,這與我們的結(jié)果相似。Anger等分別通過組織病理切片和OCT對靈長類動物的視網(wǎng)膜進(jìn)行了測量,也發(fā)現(xiàn)前者所得結(jié)果偏小,并由此提出來“非線性收縮”的概念?！胺蔷€性收縮”,是指在石蠟切片制作過程中,因視網(wǎng)膜各亞層所含成分不同,其對脫水、浸臘等過程的反應(yīng)各不相同,因此視網(wǎng)膜各亞層變薄收縮的比例也不同。視網(wǎng)膜的收縮主要發(fā)生在細(xì)胞間,細(xì)胞內(nèi)的收縮遠(yuǎn)不如細(xì)胞間明顯。因視網(wǎng)膜各層所含成分不同,其對脫水、浸臘等過程的反應(yīng)各不相同,因此視網(wǎng)膜各亞層變薄收縮的比例不同(圖4)。在我們的實驗研究中,石蠟切片結(jié)構(gòu)顯示外界膜至視網(wǎng)膜色素上皮層厚度明顯較冰凍切片及頻域OCT小,而內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層的厚度與冰凍切片并無明顯差異,是由于外界膜至視網(wǎng)膜色素上皮層主要由感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)和外節(jié)組成、水分含量高,因此收縮的比例最大。該結(jié)果與Anger等用不同方法對靈長類動物視網(wǎng)膜的觀察結(jié)果一致,也驗證了“非線性收縮”的概念。冰凍切片相對更為接近頻域OCT測量的結(jié)果,原因是制作冰凍切片時,不存在脫水、浸臘等步驟,所得病理切片各亞層厚度均接近OCT活體測量的厚度,更能代表真實的視網(wǎng)膜厚度。同時,冰凍切片更好地保存了組織上的蛋白和抗原,為進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光或免疫組織化學(xué)實驗提供了可能。但在制作冰凍切片過程中發(fā)現(xiàn),容易產(chǎn)生因玻璃體后脫離而導(dǎo)致的神經(jīng)纖維層不完整,而對我們觀察神經(jīng)纖維層造成了一定的困難,所以冰凍切片并不利于視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的觀察和定量測量;而且因冰凍切片缺少脫水的步驟,在切片制作過程中,易產(chǎn)生冰晶和空泡,故冰凍切片所得的圖像比石蠟切片分辨率低,細(xì)胞形態(tài)差,這可能會對腫瘤的診斷等定性研究產(chǎn)生一定的影響。作為惟一能直接檢測活體視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)技術(shù)的頻域OCT,在觀察大鼠視網(wǎng)膜方面存在明顯的優(yōu)勢。OCT可以檢測活體大鼠視網(wǎng)膜組織,且對活體視網(wǎng)膜組織進(jìn)行高達(dá)微米級的定量測量,所得結(jié)果更接近實際數(shù)值,并且可以實現(xiàn)對視網(wǎng)膜的連續(xù)觀察。但是其神經(jīng)纖維層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層之間分界不如石蠟切片清楚,所以在觀察兩層時相對石蠟切片有明顯不足。綜上所述,組織病理學(xué)切片(石蠟切片和冰凍切片)及頻域OCT均可對大鼠視網(wǎng)膜各亞層進(jìn)行定性及定量觀察,其具有各自獨特的特點,同時也具有很好的一致性。在進(jìn)行動物實驗視網(wǎng)膜的定量