視網(wǎng)膜新生血管angii和vegf的表達

視網(wǎng)膜新生血管angii和vegf的表達

0血管內(nèi)皮功能因子分析視網(wǎng)膜新血管是糖尿病視網(wǎng)膜病變和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的主要特征。在這些增生性視網(wǎng)膜病變中,視網(wǎng)膜新生血管形成導致視網(wǎng)膜水腫、出血、脫離等嚴重影響視力的并發(fā)癥。盡管刺激視網(wǎng)膜新生血管生長的因素還未完全明確,但有證據(jù)顯示參與此過程的不僅有血管源性的細胞因子如血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF),還包括血管活性激素如血管緊張素II(angiotensinII,AngII)。在增生性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展過程中,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)中主要效應介質AngII可能與特異性生長因子特別是VEGF相互作用來影響視網(wǎng)膜的發(fā)育和功能,最終共同導致視網(wǎng)膜新生血管形成。本研究的目的在于探討視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生發(fā)展過程中,AngII和VEGF影響視網(wǎng)膜新生血管形成的機制。1材料和方法1.1藥品試劑及試劑實驗動物:鼠齡7d的健康C57BL/6J清潔級新生小鼠(中國醫(yī)科大學動物部)40只,體質量4.0～5.0g,性別不限,與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)。藥品試劑:卡托普利(美國Bristol-MyersSquibb公司)、纈沙坦(瑞士Novartis公司)、BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)、ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)、異硫氰酸葡聚糖熒光素(美國Sigma公司)、兔抗小鼠AngII多克隆抗體(美國Sigma公司)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗體(美國Sigma公司)、羊抗小鼠IgG-HRP(美國Sigma公司)。1.2小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮形態(tài)及angiii及vegf蛋白表達動物分組和模型建立:將40只7d齡C57BL/6J清潔級新生小鼠隨機分為兩組:正常對照組和高氧模型組,每組20只。參照Smith等的方法建立氧誘導視網(wǎng)膜病變模型,高氧模型組小鼠及哺乳母鼠置于密閉氧箱中,控制氧濃度為(75±2)%,5d(鼠齡12d)后回到正常空氣環(huán)境中,正常對照組一直置于正?？諝猸h(huán)境中。所有動物保持溫度(21±1)°C,光照-黑暗循環(huán)/12h。熒光素血管灌注視網(wǎng)膜鋪片:兩組鼠齡17d的小鼠各取2只,將異硫氰酸葡聚糖熒光素(分子量:2×106)溶于1mL的40g/L多聚甲醛中,經(jīng)左心室灌注(30mL/kg),摘取眼球,于40g/L多聚甲醛中固定1h,游離視網(wǎng)膜,以視盤為中心呈放射狀對稱切開,用抗熒光衰退封片劑將視網(wǎng)膜封片,采用熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)的變化。突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核計數(shù):兩組鼠齡17d的小鼠各取3只,摘除眼球后,于40g/L多聚甲醛中固定24h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,平行于角膜至視盤的矢狀位連續(xù)6μm切片,蘇木素-伊紅染色。每只眼球取10張切片,每組30張,由同一操作者采用隨機、盲法在光學顯微鏡(日本Olympus公司)下對切片樣本計數(shù)每張切片突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)。選取切片時注意避開視盤周圍,計數(shù)血管內(nèi)皮細胞核時僅計數(shù)與內(nèi)界膜有緊密聯(lián)系的細胞核,不包括玻璃體腔內(nèi)其它與內(nèi)界膜無聯(lián)系的血管內(nèi)皮細胞核。Westernblot檢測AngII及VEGF蛋白表達:兩組鼠齡17d的小鼠各取15只,每組取5只新生鼠雙眼完整的視網(wǎng)膜,提取視網(wǎng)膜組織蛋白質,用BCA蛋白定量試劑盒定量視網(wǎng)膜組織蛋白質含量,每個樣品上樣含量50μg,以100g/LSDS電泳(4℃,120V,2h)分離蛋白質,電轉移法將蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜上,用40g/L脂奶粉,于4℃下過夜封閉硝酸纖維素濾膜的非特異性蛋白質結合位點,將濾膜于兔抗小鼠AngII多克隆抗體(1∶400)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗體(1∶400)在37℃下孵育2h,TBS-T緩沖液沖洗濾膜3次后,將濾膜轉移至二抗羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1000),37℃下孵育1h,TBS-T緩沖液再次沖洗濾膜后,ECL化學發(fā)光顯影。采用β-actin(1∶400)作為內(nèi)參照。每組樣品重復檢測3次。應用QuantityOne4.2軟件分析,分別比較各組AngII,VEGF條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值,表示各組蛋白相對表達水平。統(tǒng)計學分析:所有數(shù)據(jù)應用SPSS16.0forWindows進行統(tǒng)計學分析,結果以xˉ±sxˉ±s表示,計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗,兩變量間相關性采用Pearson相關分析,以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1血管形態(tài)與形態(tài)正常對照組自視盤發(fā)出的血管向四周呈放射狀均勻分布,直至視網(wǎng)膜周邊部,視網(wǎng)膜血管交叉成網(wǎng)狀,分深淺兩層,淺層血管呈放射狀分支形態(tài),深層血管呈多角形網(wǎng)狀形態(tài),兩層血管通過螺旋血管互相連接(圖1A);而高氧模型組視盤周圍可見大片無灌注區(qū),視網(wǎng)膜血管不規(guī)則擴張,走行迂曲,無灌注區(qū)周圍可見大量新生血管叢,伴明顯熒光滲漏(圖1B)。2.2皮細胞核的確定正常對照組未發(fā)現(xiàn)或僅在少數(shù)切片中發(fā)現(xiàn)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核(圖2A);而高氧模型組可見較多突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核,有些單獨出現(xiàn),有些成簇出現(xiàn)(圖2B),與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00)。2.3兩組視網(wǎng)膜vegf蛋白表達比較Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)2組視網(wǎng)膜均有AngII蛋白表達,AngII蛋白在正常對照組視網(wǎng)膜中表達微弱,而在高氧模型組視網(wǎng)膜中表達顯著上調,與正常對照比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00;圖3)。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)四組視網(wǎng)膜中均有VEGF蛋白表達,VEGF蛋白在正常對照組視網(wǎng)膜中表達微弱,而在高氧模型組視網(wǎng)膜中表達顯著上調,與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00;圖3)。經(jīng)Pearson相關分析,在氧誘導視網(wǎng)膜病變中,AngII和VEGF蛋白的表達呈明顯正相關(r=0.83,P=0.00)。3ras在視網(wǎng)膜新生血管生成中的作用本研究利用氧誘導視網(wǎng)膜病變模型,目的在于探討AngII和VEGF在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生發(fā)展中的作用。我們的研究顯示:在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生發(fā)展過程中,AngII和VEGF蛋白水平升高,且兩者呈正相關。已有研究表明,完整的RAS存在于人類和多種生物的視網(wǎng)膜中。AngII作為RAS的主要成分和效應分子,由血管緊張素I在血管緊張素轉換酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)和絲氨酸蛋白酶的作用下轉化生成,通過血管緊張素II1型受體(angiotensinIItype1receptor,AT1R)和血管緊張素II2型受體(angiotensinIItype2receptor,AT2R)發(fā)揮作用。AngII不僅是一種血管活性物質,而且還是一種生長因子,可以促進多種血管細胞的擴散、轉移以及合成,從而引起血管生成和重建;同時,AngII也參與細胞生長、分化、凋亡和細胞外基質沉積等各種細胞性活動;另外,AngII也在調節(jié)血壓、交感神經(jīng)活動和維持水、電解質平衡等許多生理活動中起著關鍵的作用;最后,AngII也參與許多病理過程,例如:心肌肥厚、心肌梗死、動脈粥樣硬化、腎病以及腫瘤。VEGF是一種具有良好血管通透性、促進血管生成的活性因子,在缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變中,VEGF表達上調并參與血-視網(wǎng)膜屏障的破壞,于疾病的早期出現(xiàn),并持續(xù)存在于整個疾病過程中。在視網(wǎng)膜周細胞和血管內(nèi)皮細胞中,AngII通過AT1R介導VEGF表達,刺激VEGF產(chǎn)生,兩者共同存在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、Müller細胞層、外核層和視網(wǎng)膜色素上皮層中,影響視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的發(fā)育。因此,在視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)中,AngII直接或通過上調其他特異性生長因子特別是VEGF來影響視網(wǎng)膜血管周細胞的功能、發(fā)揮促新生血管形成等作用。所以,通過阻滯RAS對以視網(wǎng)膜新生血管為特征的增生性視網(wǎng)膜病變的防治和轉歸有重要意義。對RAS的阻滯,主要通過ACEI和ARB來抑制AngII,從而發(fā)揮抑制新生血管形成的作用,但兩者作用機制有所不同。ACEI是通過阻斷ACE,減少AngII生成來發(fā)揮其作用;而ARB則是通過選擇性阻斷AT1R和AngII結合而發(fā)揮拮抗作用。實驗結果表明,AngII在視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生發(fā)展中成為一個關鍵性的因子,RAS在增生性視