第五章 海洋微藻的細(xì)胞操作

第五章

海洋微藻的細(xì)胞操作1.概論海洋微藻是海洋初級(jí)生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者，其中許多種類(lèi)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。例如：螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白，是藍(lán)色色素的重要資源。鹽藻可以積累甘油和類(lèi)胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素和變泡藻黃素，這些物質(zhì)具有很高的保健和藥用價(jià)值。紫球藻是重要的海藻多糖和不飽和脂肪酸來(lái)源藻，其多糖的藥用價(jià)值不容忽視。一些微藻如褐紫藻、等鞭金藻、扁藻、菱形藻和小環(huán)藻等是海珍品如蝦、海參、鮑魚(yú)、和扇貝幼體等生長(zhǎng)發(fā)育的餌料。這些微藻的培養(yǎng)和改良對(duì)海珍品的養(yǎng)殖具有重要意義。一些微藻是生理生化、代謝、發(fā)育和遺傳學(xué)研究的極好材料，植物的一些生理現(xiàn)象、代謝途徑和發(fā)育過(guò)程都是以微藻為實(shí)驗(yàn)材料探明的。海洋微藻細(xì)胞操作的意義微藻因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，成為原生質(zhì)體制備、再生和增殖、細(xì)胞融合以及細(xì)胞工程等細(xì)胞操作和基因工程研究的極好材料。絕大多數(shù)海洋微藻有細(xì)胞壁，其細(xì)胞操作收到了限制。因此，海洋微藻細(xì)胞操作的第一步是去除細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體。通過(guò)原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞操作和遺傳飾變的要點(diǎn)概況成為：（1）原生質(zhì)體的分離（2）原生質(zhì)體的培養(yǎng)及再生（3）細(xì)胞融合（4）把外源遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器或微生物導(dǎo)入原生質(zhì)體海洋微藻細(xì)胞操作研究的歷史與現(xiàn)狀50年代末期，F(xiàn)uhs利用絲狀體藍(lán)藻制備得到原生質(zhì)體。70年代其他種類(lèi)的原生質(zhì)體的制備也獲得成功。這些微藻原生質(zhì)體分離成功為海藻原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)研究提供了寶貴的基礎(chǔ)資料，為80年代大型海藻原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)工作的活躍開(kāi)展奠定了寶貴的基礎(chǔ)。從80年代開(kāi)始，微藻原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)以及細(xì)胞融合的研究逐漸向大型海藻轉(zhuǎn)移，這種研究重點(diǎn)的轉(zhuǎn)移似乎可以說(shuō)明，大型海藻的遺傳飾變更加困難和復(fù)雜，在理論和實(shí)踐上有更多的問(wèn)題需要解決。微藻細(xì)胞操作的有關(guān)問(wèn)題微藻細(xì)胞操作的材料應(yīng)具備下列特征

1.生長(zhǎng)狀態(tài)良好、健康

2.形態(tài)簡(jiǎn)單均一

3.細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組成簡(jiǎn)單易于原生質(zhì)體化

4.原生質(zhì)體能穩(wěn)定的再生和增殖

5.可在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖選擇

6.具有可供選擇的標(biāo)記（如抗生素的耐性）細(xì)胞操作的全過(guò)程應(yīng)保持在細(xì)胞的正常生理狀態(tài)，這在再生和增殖階段更為重要。需要注意的要點(diǎn)是：

1.處理前細(xì)胞狀態(tài)的控制

2.處理過(guò)程細(xì)胞狀態(tài)的控制，特別是外界條件如：溫度、光照、鹽度、PH、和處理時(shí)間等的控制

3.滲透壓調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度

4.原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性

5、原生質(zhì)體的純化方法及純度

6、不同研究目的的不同原生質(zhì)體化程度。5.2海洋微藻的分離和純化技術(shù)在以海洋為材料的的各種研究中，常常要求培養(yǎng)物是單種和無(wú)菌的。為實(shí)現(xiàn)這一目的，合適的分離和純化技術(shù)是必需的。5.2.1藻的采集藻體的最初來(lái)源一般是采自自然環(huán)境。浮游藻可用浮游生物網(wǎng)采集和濃縮。附著的和絲狀體種類(lèi)可以從礁石、葉狀體或其他大型藻類(lèi)上刮取。當(dāng)藻種采集后，必需在最短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行觀(guān)察、鑒定和分離，應(yīng)為有一些重要的微藻種類(lèi)在幾小時(shí)后可能開(kāi)始解體。5.2.2分離方法1.毛細(xì)滴管復(fù)洗技術(shù)選直徑較細(xì)（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時(shí)，快速拉成口徑極細(xì)的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認(rèn)真仔細(xì)地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達(dá)到純分離的目的。如不成功，應(yīng)反復(fù)幾次，直至達(dá)到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個(gè)培養(yǎng)皿中接20～30個(gè)個(gè)體。從分離出少量細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長(zhǎng)時(shí)期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（1000～5000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純?cè)宸N。2.噴霧技術(shù)

相當(dāng)簡(jiǎn)捷的技術(shù)，可用來(lái)分離和純化采集的藻樣。用離心洗滌法洗8~9ml藻樣，最后離心一次后，在離心管中留2ml上清液，其余倒掉。將毛細(xì)管通過(guò)棉塞插到離心管的底部，將離心管固定于滴定臺(tái)上。將壓縮空氣通過(guò)一滴管吹出并從離心管中的毛細(xì)管的頂端通過(guò)。離心管中的懸浮液會(huì)被吸出并形成細(xì)霧。將一滅菌的瓊脂培養(yǎng)基平板迅速通過(guò)細(xì)霧，距離大約為25cm左右。蓋好培養(yǎng)皿，至于合適的光照和溫度下培養(yǎng)。經(jīng)幾天生長(zhǎng)后，可用毛細(xì)滴管將沒(méi)有細(xì)菌和真菌污染的單細(xì)胞或藻落挑出移入新鮮培養(yǎng)液中。3.瓊脂板技術(shù)

將采集的少量藻與已冷卻的但未凝固的含有營(yíng)養(yǎng)物的瓊脂培養(yǎng)液混合，攪勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固。在適宜條件下經(jīng)幾天培養(yǎng)后，將形成的藻落切下，再移入新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)。5.2.3純化方法1.離心洗滌技術(shù)

細(xì)菌和海藻一般可以較容易地通過(guò)離心和在無(wú)菌培養(yǎng)液中洗滌分開(kāi)來(lái)。2.抗生素技術(shù)

用混合的抗生素可以成功地純化海藻培養(yǎng)物，這一方法特別適用于那些較大的不適于離心洗滌的藻類(lèi)。3.紫外光處理技術(shù)紫外光可用來(lái)處理純化海洋微藻，因?yàn)榇蠖鄶?shù)藻類(lèi)對(duì)紫外線(xiàn)處理的致死效應(yīng)比細(xì)菌的抗性強(qiáng)。4.過(guò)濾技術(shù)膜濾可用來(lái)分離絲狀體海藻和細(xì)菌。5.純化程度的檢測(cè)

經(jīng)純化的培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)以確定培養(yǎng)物是否真正逮到了無(wú)菌，用一般性培養(yǎng)基做檢測(cè)在不同溫度和光暗條件下進(jìn)行。5.3培養(yǎng)基成分及作用海水是海藻生長(zhǎng)的理想介質(zhì)，自然海水可以滿(mǎn)足孢子萌發(fā)和不同藻種的分離等研究的需要，但在多數(shù)的培養(yǎng)中，用幾種植物培養(yǎng)物如N、P、和Fe等加富海水是必要的。合成培養(yǎng)基的主要目的是提供簡(jiǎn)化的和確定的培養(yǎng)基。在配制培養(yǎng)基的過(guò)程中，一個(gè)主要的問(wèn)題是海水培養(yǎng)基高壓滅菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生沉淀。目前，解決這一問(wèn)題的途徑主要有兩個(gè)：

1.加入某種適宜且無(wú)毒的PH緩沖劑和螯合物，同時(shí)降低培養(yǎng)基的鹽度，特別是鈣的濃度。

2.用濾膜過(guò)濾的方法滅菌。用于藻類(lèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方有很多種，每種配方主要適用于一定藻種，這里介紹幾種比較常用的。水生4號(hào)和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍(lán)藻可用朱氏10號(hào)或水生105號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍(lán)藻）；硅藻可用朱氏10號(hào)和水生硅1號(hào)培養(yǎng)基；另外還有海產(chǎn)綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基配方見(jiàn)下表。以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無(wú)海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內(nèi)加入1.5％瓊脂。培養(yǎng)基的配制及其原則一、培養(yǎng)基母液的配制(一)母液配制的目的

1.方便配制其它的培養(yǎng)基：

2.保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取。

(二)母液配制方法

1.單配法將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)。

2.混配法將幾類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱(chēng)量，分別溶解后每一類(lèi)混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可用amg/L表示，即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液aml。

（三）母液配制的藥品與器材

1、藥品：配制藻類(lèi)培養(yǎng)基所需的藥品、蒸餾水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL等。2、器材：各類(lèi)天平、燒杯、容量瓶、量筒、母液瓶、標(biāo)簽、冰箱等。（四）母液配制（以MS培養(yǎng)基為例）

無(wú)機(jī)大量母液鐵鹽母液配制MS培養(yǎng)基時(shí)母液的計(jì)算二、培養(yǎng)基的配制

海藻的培養(yǎng)基一般由三部分組成：大量元素、微量元素和維生素。配置步驟：無(wú)菌海水（600-700ml）

母液的量取溶解

液

調(diào)PH定容（1L）分裝1.量取前先檢查母液并搖動(dòng)2.量母液前,移液管和量筒應(yīng)潤(rùn)洗三、配制藻類(lèi)培養(yǎng)基的原則

1、要有適量氮源（除固氮藍(lán)藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機(jī)氮等。

2、應(yīng)包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等

3、要考慮各種鹽類(lèi)總濃度和pH是否適合藻類(lèi)需要，可用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH。

4、要加入各種藻類(lèi)需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。

5、要滿(mǎn)足某些藻類(lèi)特殊需要，如藍(lán)藻需鉬，硅藻需硅。

6、要添加適量生長(zhǎng)物質(zhì)如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。

MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基。其具有較高的無(wú)機(jī)鹽濃度，能夠保證組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)還能加速愈傷組織的生長(zhǎng)。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存和消毒等過(guò)程中，即使有些成分略有出入，也不會(huì)影響離子間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用于誘導(dǎo)愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)能獲得明顯的成功。MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿(mǎn)足植物細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機(jī)附加成分。和其它培養(yǎng)基的基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的顯著特點(diǎn)。5.4海洋微藻的生長(zhǎng)測(cè)量和培養(yǎng)技術(shù)5.4.1培養(yǎng)類(lèi)型

海洋微藻的培養(yǎng)類(lèi)型按時(shí)間長(zhǎng)短分為：1.長(zhǎng)期保存培養(yǎng)2.短期保存培養(yǎng)類(lèi)型長(zhǎng)期保存培養(yǎng)短期保存培養(yǎng)定義

指長(zhǎng)時(shí)間保持一特定的海藻以備將來(lái)的使用的培養(yǎng)，能在長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月甚至1年的時(shí)間里保持藻的活力

指藻體材料用于實(shí)驗(yàn)前的較短時(shí)間的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用法

一般不宜直接用于實(shí)驗(yàn)

可以直接用于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：如蛋白胨的Bold營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,用于綠藻的長(zhǎng)期保存培養(yǎng)獲得正常微藻較低濃度培養(yǎng)基加速生長(zhǎng)較高濃度培養(yǎng)基缺點(diǎn)（1）營(yíng)養(yǎng)物必須是無(wú)菌的（2）某些藻在瓊脂培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)

不能長(zhǎng)期保存5.4.2生長(zhǎng)測(cè)定

1.分裂速率的計(jì)算

生長(zhǎng)規(guī)律：慢——塊——慢

生長(zhǎng)指標(biāo)：細(xì)胞數(shù)目適宜條件下，當(dāng)生長(zhǎng)速度達(dá)恒定時(shí)（指數(shù)生長(zhǎng)期），細(xì)胞增加的速度與原來(lái)細(xì)胞數(shù)目之間有：表示在和時(shí)測(cè)得的細(xì)胞數(shù)。若用以2為底的對(duì)數(shù)來(lái)計(jì)算生長(zhǎng)常數(shù)，則和這時(shí)k的意義為每天分裂的次數(shù)K（分裂次數(shù)/d）=Ke/ln2生長(zhǎng)常數(shù)也可以用細(xì)胞加倍時(shí)間DT表示：DT=1/K=ln2/Ke2.細(xì)胞計(jì)數(shù)方法1）血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法

血球計(jì)數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四條下凹的槽,構(gòu)成三個(gè)平臺(tái).中間的平臺(tái)較寬,其中間又被一短橫槽隔為兩半,每半邊上面,刻有一個(gè)方格網(wǎng).方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格,其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室,供微生物計(jì)數(shù)用.這一大方格的長(zhǎng)和寬各為1mm,深度為0.1mm,其體積為0.1mm3.計(jì)數(shù)室通常有兩種規(guī)格.一種是大方格內(nèi)分為16中格,每一中格又分為25小格;另一種是大方格內(nèi)分為25中格,每一中格又分為16小格.但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造;它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn),即每一大方格都是由16×25=25×16=400個(gè)小方格組成,見(jiàn)圖.計(jì)數(shù)方法：用酒精擦洗計(jì)數(shù)板取一滴藻液滴在蓋玻片一側(cè)邊緣，使它沿著蓋玻片和計(jì)數(shù)板間的縫隙滲入計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)

1ml細(xì)胞數(shù)=1個(gè)大方格（0.1ul）細(xì)胞數(shù)×10×10002)光密度法

原理：分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。方法:用分光光度計(jì)測(cè)得各濃度藻類(lèi)的光度值，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，光度值為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞數(shù)和光度值的對(duì)應(yīng)曲線(xiàn)。利用這一曲線(xiàn)，在測(cè)得樣品的光度值后，可以查得樣品的細(xì)胞數(shù)。

優(yōu)點(diǎn)：計(jì)數(shù)快速方便5.4.1培養(yǎng)方法1.分批培養(yǎng)2.連續(xù)培養(yǎng)3.同步培養(yǎng)1.分批培養(yǎng)

分批培養(yǎng)是指在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量微藻種進(jìn)行培養(yǎng)，使微藻生長(zhǎng)繁殖，在特定條件下完成一個(gè)生長(zhǎng)周期的培養(yǎng)方法。是最簡(jiǎn)單和普遍采用的方法。單胞藻的生長(zhǎng)可分為：生長(zhǎng)延緩期：細(xì)胞剛開(kāi)始適應(yīng)環(huán)境，所以生長(zhǎng)并不旺盛，生長(zhǎng)曲線(xiàn)基本呈平線(xiàn)狀指數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞適應(yīng)了環(huán)境，生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)速度極快，細(xì)胞數(shù)量呈倍數(shù)增長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線(xiàn)陡然上升靜止期：因培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物有限，而細(xì)胞此時(shí)數(shù)量已達(dá)很多，相互間競(jìng)爭(zhēng)，所以死亡的細(xì)胞數(shù)和新生的細(xì)胞數(shù)持平，生長(zhǎng)曲線(xiàn)再次呈平線(xiàn)。2.連續(xù)培養(yǎng)

指在一個(gè)限定的系統(tǒng)中，通過(guò)不斷加入新鮮的營(yíng)養(yǎng)液，在生長(zhǎng)速度和稀釋速度間建立一種平衡的關(guān)系，使培養(yǎng)液細(xì)胞濃度保持一定的培養(yǎng)方法。分為：（1）半連續(xù)培養(yǎng)：定期定量加入營(yíng)養(yǎng)液，定期定量取出培養(yǎng)物。（2）全連續(xù)培養(yǎng)：不斷加入營(yíng)養(yǎng)液的同時(shí)營(yíng)養(yǎng)液又不斷流出。3.同步培養(yǎng)采取某種措施（變換光暗周期，溫度和營(yíng)養(yǎng)條件），使培養(yǎng)液中的藻類(lèi)處于細(xì)胞周期中同一時(shí)期的培養(yǎng)方法。優(yōu)點(diǎn)：每一周期均可得到細(xì)胞數(shù)目、干物質(zhì)和細(xì)胞組成一致的材料同步培養(yǎng)的方法有誘導(dǎo)法和選擇法兩種。(一)誘導(dǎo)法

控制環(huán)境條件。誘導(dǎo)法就是采用物理、化學(xué)因子使微藻細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行到某個(gè)階段而停下來(lái)，使先到達(dá)該階段的微藻細(xì)胞個(gè)體能進(jìn)人下一生長(zhǎng)階段，待全部群體細(xì)胞都到達(dá)該生長(zhǎng)階段后，再除去該因子，使全部群體細(xì)胞同時(shí)進(jìn)人下—個(gè)生長(zhǎng)階段，以達(dá)到誘導(dǎo)微藻細(xì)胞同步生長(zhǎng)的目的。（二）選擇法：用密度梯度離心或微孔濾膜，分離剛分裂的小細(xì)胞（體積和重量大致相等），然后再培養(yǎng)即可。5.5原生質(zhì)體分離技術(shù)本節(jié)要點(diǎn)：原生質(zhì)體與原生質(zhì)球檢測(cè)細(xì)胞壁存在的方法海藻原生質(zhì)體的制備方法原生質(zhì)體分離方法一.原生質(zhì)體與原生質(zhì)球

根據(jù)藻類(lèi)細(xì)胞脫壁程度的不同，將脫壁后的藻細(xì)胞分為原生質(zhì)體和和原生質(zhì)球。原生質(zhì)體：是指質(zhì)膜外的細(xì)胞壁和包被層全部除去而保持其余細(xì)胞組分的任何基因型的藻細(xì)胞。原生質(zhì)球是指細(xì)胞壁被全部或部分除去，仍保持質(zhì)膜外包被層的含全部細(xì)胞內(nèi)組分的部分

原生質(zhì)體與原生質(zhì)球的區(qū)別：

原生質(zhì)球：細(xì)胞壁完全或部分去除，包被原生質(zhì)球：細(xì)胞壁和包被層全部去除層完整保留。原生質(zhì)體的特征：（1）無(wú)細(xì)胞壁障礙，可對(duì)膜、細(xì)胞器進(jìn)行基礎(chǔ)研究，同時(shí)可進(jìn)行遺傳操作。（2）具有全能性，能在人工條件控制下，進(jìn)行大量，快速繁殖。（3）可誘導(dǎo)融合，形成雜種細(xì)胞，為體細(xì)胞雜交提供實(shí)驗(yàn)材料。由于質(zhì)膜外的包被層存在與否尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法，故原生質(zhì)體與原生質(zhì)球間的差別常被忽略。

二.檢測(cè)細(xì)胞壁存在的方法電子顯微鏡細(xì)胞壁染色技術(shù)處理后的細(xì)胞對(duì)滲透脅迫的敏感性三.海藻原生質(zhì)體的制備方法海藻原生質(zhì)體的制備方法有機(jī)械法、微生物酶解法和酶法。機(jī)械法由于原生質(zhì)體得率太低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力目前已很少使用。微生物酶解法：利用海洋細(xì)菌與藻體共培養(yǎng)過(guò)程中釋放出來(lái)的特殊酶，把海藻細(xì)胞壁分解掉從而得到原生質(zhì)體