蝦主要過敏反應(yīng)原肌球蛋白的小鼠致敏模型構(gòu)建及評價

蝦主要過敏反應(yīng)原肌球蛋白的小鼠致敏模型構(gòu)建及評價

食物引起的免疫疾病已成為一個重要的食品安全問題。根據(jù)該報告，成人過敏發(fā)生率約為3%4%，兒童過敏發(fā)生率約為6%。隨著轉(zhuǎn)基因食品更多地出現(xiàn)在餐桌上,其潛在致敏性越來越受到人們的廣泛關(guān)注。動物模型試驗是2001年FAO/WHO生物技術(shù)食品致敏性聯(lián)合專家咨詢會議發(fā)布的轉(zhuǎn)基因食品致敏性評估樹狀分析策略中新增加的評估方法。目前國內(nèi)外已經(jīng)報道了多種用于評價過敏原性的過敏癥動物模型。其中報道較多的是基于大鼠、小鼠、豚鼠、豬、狗的動物模型。Dearman等用腹膜內(nèi)致敏作用建立了Balb/c小鼠(8~16周,雌性)模型,其用花生凝集素和土豆凝集素刺激小鼠2周(未用佐劑)后,發(fā)現(xiàn)花生凝集素刺激后血清中IgE抗體檢測結(jié)果呈陽性,土豆凝集素刺激后的IgE檢測結(jié)果呈陰性。佐劑能輔助動物的致敏反應(yīng),有學(xué)者用氫氧化鋁作佐劑成功構(gòu)建了豚鼠的食物過敏模型。與其他動物相比,Balb/c小鼠成本低、周期短且抗原消耗量低,較適合作為食物過敏動物模型。本研究選用Balb/c小鼠,經(jīng)腹腔注射給予常見致敏食物蛋白質(zhì)卵清蛋白(OVA)、蝦主要過敏原原肌球蛋白(Tropomyosin,Tm)、無花果蛋白酶處理后的Tm(Tm-E)和陰性對照PBS組,通過檢測免疫小鼠血清中IgE和IgG抗體的變化情況,對蝦主要過敏原Tm的致敏動物模型構(gòu)建方法進行了探討。1材料和方法1.1opd、bsa和牛血清蛋白南美白對蝦(活)市售;卵清蛋白,HRP-羊抗鼠IgE和氫氧化鋁購自Thermo公司;OPD購自Sigma公司;BSA(牛血清蛋白)購自生工生物工程(上海)有限公司;HRP-羊抗鼠IgG購自Millipore公司;HRP-兔抗鼠IgG購自Invitrogen公司;其他試劑如無特殊說明,均為國產(chǎn)分析純。1.2轉(zhuǎn)膜及凝膠試劑蛋白質(zhì)電泳儀(miniprotean4):美國BIO-RAD;半干式轉(zhuǎn)膜儀(AE-8135):日本ATTO公司;凝膠掃描儀(powerlook2100XL-USB):UMAX公司;酶標(biāo)儀:Biotek公司。1.3實驗動物6~8周齡Balb/c小鼠29只,雌性,購自復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部,清潔級。自由飲水、飲食,飼料中不含受試蛋白質(zhì)。1.4蛋白液的制備抽提方法參照張軼群等方法并略有修改,將去頭去殼去腸線的蝦肉勻漿,脫脂,干燥制成丙酮粉。用PBS(0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液,pH7.2)以1∶20(w/v)的比例抽提過夜,8000r/min離心20min后取上清,水浴加熱10min后放冰上冷卻5min,過濾去除雜蛋白。然后取濾液10000r/min離心10min,所得上清經(jīng)35%和55%硫銨濃縮后,離心取沉淀用超純水溶解,透析。透析液經(jīng)冷凍干燥后儲藏于-35℃冰箱中備用。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定采用BCA法,具體方法參照生工BCA定量試劑盒說明書。1.5凝膠成像系統(tǒng)配制5%濃縮膠和12%分離膠。取樣品加入2×樣品緩沖液,沸水浴加熱3~5min后作為上樣樣品。電泳后凝膠以考馬斯亮藍(lán)染色,凝膠成像系統(tǒng)成像。SDS凝膠電泳后,半干法轉(zhuǎn)膜1h,然后加入含1%BSA的PBS溶液中封閉反應(yīng)1h。接著分別加入一抗5G5E和二抗(HRP-兔抗鼠IgG,1∶5000)各室溫反應(yīng)1h,最后加入DAB顯色液。1.6蝦主要是一種抗性疾病，是非原肌球蛋白的消除處理將富集后的Tm用無花果蛋白酶處理,酶活與底物比13.6U/g,35℃酶解10min,沸水浴加熱3min滅活酶解液。1.7小鼠血清學(xué)實驗29只Balb/c小鼠隨機分為4組,分別為OVA組(陽性對照組,6只)、Tm組(10只)、無花果蛋白酶處理后的Tm組(Tm-E,7只)、PBS組(陰性對照組,6只)。飼養(yǎng)1周后開始實驗。各組小鼠腹腔注射,致敏方式為各組樣品與氫氧化鋁3∶1混合,蛋白質(zhì)量濃度為1mg/ml,0.25ml/只注射。陰性對照組為PBS與氫氧化鋁佐劑3∶1(v/v)混合。強化刺激時蛋白質(zhì)量濃度為2mg/ml,0.25ml/只,陰性對照組只注射PBS。每次注射間隔時間為1周,注射后第4天尾部取血,其中第24天和第38天強化刺激。血液37℃孵育1h,4℃過夜凝集,2000g離心10min分離血清,分別于-35℃凍存?zhèn)溆?圖1)。1.8hrp-羊抗鼠igg的制備取96孔酶標(biāo)板,每孔加入100μl致敏原(5μg/ml),37℃孵育1.5h。用PBS(含0.05%Tween-20)洗滌3次后用含2%牛血清白蛋白的PBS溶液37℃封閉1h;然后每孔加入100μl小鼠血清稀釋樣品,37℃孵育1h,洗滌后分別加入HRP-羊抗鼠IgE和HRP-羊抗鼠IgG(100μl/孔),37℃孵育1h。洗滌后加入OPD底物溶液,室溫孵育20min,用2mol/L硫酸50μl/孔終止反應(yīng),490nm波長下測定吸光值。1.9統(tǒng)計分析用SPSS17.0進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,通過方差分析,比較卵清蛋白和無花果蛋白酶處理前后蝦蛋白過敏反應(yīng)差異的顯著性。2結(jié)果2.1蝦主要是一種抗性疾病，是非原肌球蛋白的消除處理2.2tme對小鼠血清ige和igg抗體的影響各實驗組的小鼠抗血清IgE和IgG抗體的檢測結(jié)果見表1。由表1可見,各試驗組在致敏24d和38d后,陰性對照組在整個刺激過程中其血清中不含有IgE和IgG抗體,OVA組在致敏38d后,其血清中的IgE和IgG抗體效價顯著提高,說明OVA具有強致敏性;Tm和TmE組在致敏24d和38d后,小鼠血清中的IgE和IgG抗體水平均顯著性增加,且經(jīng)無花果蛋白酶處理后的Tm-E組在同等效價下,其血清中的IgE和IgG抗體含量均顯著低于Tm組,2組中的IgE抗體量具有極顯著性差異(P<0.01),Tm-E組在致敏24d和38d時其IgE的OD值分別較Tm組低77.83%和64.06%。上述結(jié)果顯示Tm經(jīng)無花果蛋白酶處理后雖有致敏反應(yīng),但其致敏性較未處理的Tm顯著降低,說明本文采用的無花果蛋白酶處理方式對蝦類主要過敏原Tm具有一定的降低過敏性效果。3balb/c致敏動物模型的制備動物模型試驗是評價食物潛在致敏性最直接的方法,狗、幼豬、豚鼠、Balb/c小鼠、C3H/HeJ小鼠、BN大鼠等作為食物過敏動物模型的試驗研究均有報道。常用的致敏方式有灌胃和腹腔注射,二者各有優(yōu)缺點,國際上目前尚未建立食物致敏原評估的標(biāo)準(zhǔn)動物模型。通常認(rèn)為適宜的食物過敏動物模型暴露于人體食物致敏原后會產(chǎn)生過敏反應(yīng),暴露于無致敏史食物后則不產(chǎn)生過敏反應(yīng),同時動物模型對不同食物致敏原產(chǎn)生的過敏反應(yīng)的強度應(yīng)與人體相類似,研究發(fā)現(xiàn)動物模型對常見食物致敏原的致敏反應(yīng)強弱順序依次為花生、堅果、小麥、大豆、大麥。目前,對蝦類的主要過敏原的研究已較為透徹,1999年國際食品法典委員會公布的常見致敏食品中,蝦蟹等甲殼類及其制品是主要的過敏食物之一。蝦中有多種過敏原組分,其中相對分子質(zhì)量為36000的Tm能與超過50%的蝦過敏患者血清IgE發(fā)生特異性反應(yīng),是蝦類的主要過敏原。本研究以O(shè)VA、Tm、無花果蛋白酶處理后的Tm和PBS為致敏原,采用腹腔注射方式使Balb/c小鼠致敏,間接ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫第24天開始,OVA、Tm、Tm-E組的Balb/c小鼠512倍稀釋血清中特異IgE和IgG抗體均較對照組升高,并有統(tǒng)計學(xué)差異;同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)無花果蛋白酶處理后的Tm-E組血清中IgE和IgG較Tm組顯著降低,說明Tm-E組的過敏原性發(fā)生了下降,但是其依然具有一定的過敏原性。Ayuso等研究發(fā)現(xiàn)過敏原Tm具有8個能與IgE結(jié)合的抗原決定簇,我們認(rèn)為本研究所采用的酶解處理方式(酶活與底物比13.6U/g,35℃酶解10min)對蝦主要過敏原Tm具有一定的消減作用,其原因很可能是這種處理方式對Tm的抗原決定簇位點有一定的破壞作用,從而使Tm-E組的過敏原性低于正常的Tm組,但此部分內(nèi)容還有待今后進一步深入研究。Balb/c小鼠具有成本低、周期短且抗原消耗量低等優(yōu)點,較適合作為食物過敏動物模型。如沈海旺等學(xué)者用鋸緣青蟹的Tm成功構(gòu)建了動物模型,該研究設(shè)立Tm致敏組和生理鹽水陰性對照組,采用灌胃的方式致敏,結(jié)果顯示,血清IgE的含量是陰性對照組小鼠的2倍。而本研究采用的是腹腔注射,以氫氧化鋁為佐劑,在38d時,血清稀釋2048倍后,血清IgE的OD值是陰性對照組小鼠的16.66倍。又如Guo等用蝦過敏蛋白腹腔注射的方式致敏8周齡的Balb/c小鼠,用無過敏原性的磷酸酶做陰性對照,用Hanks平衡鹽溶液做空白對照,不使用佐劑情況下構(gòu)建了蝦過敏原Tm的動物模型,但這種方法對抗原消耗量較大。致敏時過敏原質(zhì)量濃度為5mg/ml,強化刺激時為10mg/ml,0.25ml/只注射;本研究以氫氧化鋁佐劑和抗原的混合液為致敏原,采用多次腹腔注射方式成功構(gòu)建了蝦主要過敏原Tm的小鼠Balb/c致敏動物模型,構(gòu)建時所需抗原量僅為Guo等研究中所用抗原量的五分之一,且所構(gòu)建動物模型所產(chǎn)生的IgE抗體效價高(>8000)且特異性強,并可有效評價Tm的過敏原性變化情況。此外本研究結(jié)果顯示,以無花果蛋白酶解處理方式(酶活與底物比13.6Ug,35℃酶解10min)可有效降低Tm的過敏原性。本研究對今后食物過敏原的低過敏性處理方法和致敏機理等研究具有一定的參考價值。經(jīng)過無花果蛋白酶酶解處理蝦過敏原Tm后的SDS和Westernblo