轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究及其在基因表達調(diào)控中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究及其在基因表達調(diào)控中的應(yīng)用

廣泛的轉(zhuǎn)移組代表細胞或組織中的所有倫字段，包括編碼蛋白質(zhì)的mrna和非編碼rn（rna、tna、pcr等）。而狹義的轉(zhuǎn)錄組系指所有編碼蛋白質(zhì)的mRNA總和。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu),揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理,已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。隨著一系列模式生物(Modelorganism)基因組測序的完成,功能基因組學(xué)的研究方興未艾。參照這些模式生物的參考序列(Referencesequence),研究人員可以很方便的研究該物種的全基因組轉(zhuǎn)錄情況、不同個體之間的SNP差異、基因拷貝數(shù)差異等。而對于非模式生物而言,情況則不容樂觀。雖然具有許多模式生物缺少的有趣特征,且其轉(zhuǎn)錄組研究對解決基因進化、遺傳育種以及生態(tài)等諸多方面的問題具有重要意義。但是由于大量的人力和財力都投入到了模式生物的基因組研究當中,導(dǎo)致非模式生物的基因組信息嚴重缺乏。沒有相應(yīng)物種的參考基因組信息,使得非模式生物轉(zhuǎn)錄組的研究舉步維艱。傳統(tǒng)的研究方法是建立cDNA文庫,Sanger法測序獲得基因,構(gòu)建基因芯片,其操作復(fù)雜,實驗周期長,花費大,讓很多研究人員望而卻步。近年來,隨著DNA高通量測序技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)了“下一代”大規(guī)模平行測序(Massiveparallelsequencing,MPS)技術(shù),如Roche公司(454GS-FLX)、Illumina公司(GenomeAnalyzerII)和ABI(ABSOLiD),這些大規(guī)模平行測序技術(shù)的出現(xiàn)已完全改變了轉(zhuǎn)錄組研究的方式,產(chǎn)生了“RNA測序技術(shù)(RNA-seq)”。RNA-seq也稱為轉(zhuǎn)錄組測序,與傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)相比,該技術(shù)可以高通量的測定轉(zhuǎn)錄組cDNA的序列,揭示特定細胞或組織中表達的全部基因或表達序列標簽(Expressedsequencetag,EST)、不同基因的相對表達豐度(表達量)(Abundance)、發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SNP、識別一個基因不同的轉(zhuǎn)錄本和可變剪切位點(不同拼接)、SSR等遺傳多態(tài)性和遺傳標記、能夠檢測未知基因、發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本等。RNA-seq提供精確的數(shù)字化信號,更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍,是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強大工具。目前,RNA-seq已經(jīng)成功用于水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的大規(guī)模EST測序研究,發(fā)現(xiàn)了這些物種更多EST。但是這些物種都是模式生物,它們不但具有完整的基因組DNA序列信息,而且具有豐富的轉(zhuǎn)錄組序列。這些已知的序列信息為測序序列的基因組定位(Mapping)或組裝(Assembly)提供強大的支持。RNA-seq在用于檢測基因表達和轉(zhuǎn)錄組研究時,最顯著的優(yōu)勢是無需像基因芯片那樣需先解碼研究物種的基因信息并設(shè)計特異性的探針。因此,RNA-seq可在沒有研究物種基因信息的情況下,直接對任何物種的轉(zhuǎn)錄組進行分析。RNA-seq的這一特征,彌補了非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究中缺乏基因組信息的不足。但是,與模式生物轉(zhuǎn)錄組研究相比,由于缺乏基因組信息,非模式生物仍不能進行測序序列的基因組定位和注釋,只能進行從頭拼裝(Denovoassembly),并通過同源比對進行測序序列的注釋和分析。這也就要求有強大的生物信息學(xué)方法和軟件作為基礎(chǔ)。不過隨著生物信息學(xué)方法的不斷進步,近年來RNA-seq已成為非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究的先進技術(shù),大量非模式生物的轉(zhuǎn)錄組得到研究。本文綜述了利用RNA-seq進行非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究的概況,總結(jié)了使用RNA-seq技術(shù)研究非模式生物轉(zhuǎn)錄組的一般流程及方法,最后對非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究中有待進一步分析的問題進行展望。1非模式生物的基因測序技術(shù)RNA-seq對非模式生物轉(zhuǎn)錄組的研究因無參考基因組(Referencegenome)信息,被稱為從頭轉(zhuǎn)錄組分析(Denovotranscriptomeanalysis)。2008年,Vera等運用454GS-20測序技術(shù)進行了第一例從頭轉(zhuǎn)錄組分析研究(M.cinxia;Lepidoptera:Nymphalidae)。之后已經(jīng)有大量的非模式生物的轉(zhuǎn)錄組通過RNA-seq得到研究(圖1)。由圖1可以看出,得到研究的非模式生物的數(shù)量在逐年增加,尤其是2010年,有高達36個非模式生物物種利用RNA-seq技術(shù)進行了轉(zhuǎn)錄組分析研究。另外,通過文獻查閱,筆者對近5年使用RNA-seq技術(shù)研究的非模式生物的情況進行了匯總(表1)。由表1可以看出,以上非模式生物的從頭轉(zhuǎn)錄組研究絕大多數(shù)是運用RocheGS-20sequencer、Roche454GS-FLX、454GS-FLXTitanium完成。只有少數(shù)是運用IlluminaGAII、GAIIx、HiSeqTM2000完成,包括油菜(B.napus)、煙粉虱(B.tabaci)、甘薯(I.batatas)、弓形蟲(T.gondii)、不吉按蚊(A.funestus)、雛豆(C.arietinumL.)、大蒜(A.sativum)、斑海豹(P.largha)、貫葉連翹(H.perforatum)、紅花(C.tinctoriusL.)、胡黃連(P.kurrooa)、鹽沼甲(P.chalceus)、靜水椎實螺(L.stagnalis)、桔小實蠅(B.dorsalis)、歐洲笠螺(P.vulgata)、首烏(P.cuspidatum)、紫甘薯(I.batatasL.)。而ABI公司的ABSOLiD技術(shù)則幾乎沒有運用,僅僅在甜瓜(C.meloL.)的SNP分析上有所運用。究其原因是SOLiD測序技術(shù)讀長較短(平均讀長50bp),并且測序運行時間較長。由于非模式生物缺乏參考基因組信息,測序讀長越長,越有利于測序片段的裝配。因此,讀長最長的Roche454技術(shù)(平均讀長400bp)在非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究中應(yīng)用最為廣泛,其次是IlluminaSolexa技術(shù)(平均讀長100bp)有少數(shù)應(yīng)用。從表1可以看出,非模式生物的從頭轉(zhuǎn)錄組研究絕大多數(shù)是由國外的科研機構(gòu)完成的,他們最先將RNA-seq技術(shù)使用到非模式動物轉(zhuǎn)錄組的研究上,而國內(nèi),則起步稍晚。目前,國內(nèi)也已經(jīng)展開了對中藥植物、農(nóng)業(yè)昆蟲等物種的從頭轉(zhuǎn)錄組研究,包括黃花蒿(A.annua)、油菜(B.napus)、煙粉虱(B.tabaci)、丹參(S.miltiorrhiza)、灰飛虱(L.Striatellus)、黃瓜(C.sativusL.)、西洋參(P.QuinquefoliusL.)、甘薯(I.batatas)、淫羊藿(E.Sagittatum)、紫杉(T.cuspidate)、蝴蝶蘭(P.orchids)、大蒜(A.sativum)、紅花(C.tinctoriusL.)、首烏(P.cuspidatum)等。這些研究證明RNA-seq在發(fā)現(xiàn)非模式生物轉(zhuǎn)錄組基因及遺傳標記中非常有效。例如用新一代高通量測序技術(shù)454GS-FLXTitanium對2年生丹參根的轉(zhuǎn)錄組進行測序,研究其基因表達譜,挖掘其功能基因,獲得46722表達序列標簽(EST),序列平均長度414bp,與Sanger測序的長度相當;所得序列與GenBank中丹參的EST合并拼接,獲得18235條唯一基因(Unigene),包括6620個序列重疊群(Contig)和11615條單一序列(Singleton),唯一基因總長7.89Mb。在全部唯一基因中,Roche454高通量測序發(fā)現(xiàn)了13980條新的唯一基因。數(shù)據(jù)庫中的序列同源性比較表明,其中73.0%(13308條)與其他生物的已知基因具有不同程度的同源性(獲得了基因注釋)。根據(jù)擬南芥蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果,被注釋序列大約包含7800個轉(zhuǎn)錄本;另有4927條唯一基因(27.0%)未被注釋,認為是可能的新基因。通過BLAST與基因本體論(GeneOntology)分析獲得了可能參與丹參酮合成的序列27條(編碼15個關(guān)鍵酶),參與丹酚酸合成的序列29條(編碼11個關(guān)鍵酶),細胞色素P450序列70條,轉(zhuǎn)錄因子序列577條。證明Roche454高通量測序技術(shù)作為藥用植物功能基因組研究的重要手段可在丹參功能基因的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮重要作用,這些基因的發(fā)現(xiàn)為丹參酮和丹酚酸類化合物生物合成研究奠定了基礎(chǔ),同時也為丹參的轉(zhuǎn)錄組研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。另外,將RNA-seq和定制基因芯片聯(lián)合使用,對于快速研究非模式生物的轉(zhuǎn)錄組非常有效。應(yīng)用第二代測序技術(shù)對非模式生物進行轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)基因或EST信息,隨后用定制“基因/EST芯片”對單個個體的基因表達情況進行快速鑒定,這一研究思路在非模式生物的功能基因組學(xué)研究方面越來越流行。例如,來自美國和芬蘭的科學(xué)家相互合作,運用第二代測序技術(shù)和定制芯片,對一種沒有參考序列的非模式生物——慶網(wǎng)蛺蝶(M.cinxia)進行研究。研究者首先提取不同家系的慶網(wǎng)蛺蝶幼蟲、蛹和成蟲混合樣本的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用第二代測序技術(shù)進行測序。共得到608053個表達序列標簽(平均長度110bp),獲得48354個重疊群和59943個單拷貝。為了保證實驗結(jié)果的正確性,研究者同時取了一部分RNA樣品,構(gòu)建cDNA文庫,用傳統(tǒng)的Sanger法測序,以此做為第二代測序結(jié)果的參照。Sanger法測序得到3888條序列,經(jīng)過拼接后,得到813條可用序列,其中749條(92%)能在第二代測序的結(jié)果中找到。這表明第二代測序的結(jié)果具有很高的準確率。由于取樣時,研究者取了不同家系的慶網(wǎng)蛺蝶做為樣本,所以依據(jù)第二代測序的結(jié)果,研究者還發(fā)現(xiàn)了慶網(wǎng)蛺蝶的一些SNP位點和可變剪接方式。隨后研究者根據(jù)測序得到的數(shù)據(jù),用Agilent的e-array自主設(shè)計基因芯片。由于昆蟲體內(nèi)一般都會有一些共生或者寄生的微生物,因此以成蟲為樣本時,就順帶提取了微生物的RNA,并進行測序,針對微生物的探針也包括在基因芯片上。研究者用自主設(shè)計的基因芯片,檢測不同家系單個慶網(wǎng)蛺蝶個體的基因表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了不同家系的慶網(wǎng)蛺蝶攜帶的微生物也不同。這一成果對于研究慶網(wǎng)蛺蝶的種群特征具有重要意義。這篇文章提供給我們一種比較新穎的研究思路。當我們想對那些沒有參考基因組信息的非模式生物進行基因組研究時,我們可以先用第二代測序技術(shù)對混合樣本進行測序,發(fā)現(xiàn)基因,根據(jù)序列數(shù)據(jù),用Agilent的e-array進行定制基因芯片,然后用基因芯片對不同種群或者不同個體的基因轉(zhuǎn)錄情況進行快速分析。2不同模式生物的rt-pcr檢測利用RNA-seq技術(shù)研究非模式生物轉(zhuǎn)錄組的一般流程主要包括:測序RNA樣品的準備、高通量DNA測序和生物信息學(xué)分析(圖2)。由于非模式生物無參考基因組信息,因此與模式生物轉(zhuǎn)錄組研究有一定的差異,例如,獲得非模式生物的RNA-seq數(shù)據(jù)后,首先需要進行測序讀段(Reads)的從頭組裝(Denovoassembly),生成唯一基因(包括重疊群和單一序列),才能進行下一步的基因注釋和生物信息學(xué)分析;而對于模式生物,則可以直接將測序讀段定位(Mapping)到參考基因組上進行基因注釋及下游分析。下面簡要介紹非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究的一般流程與方法。2.1樣品準備2.1.1浮浪幼蟲的篩選和重新測序根據(jù)所研究的非模式生物及其研究目的,需要選擇性地采集不同的樣本。例如,Vera等在研究慶網(wǎng)蛺蝶(M.cinxia)轉(zhuǎn)錄組時,采集了不同家系慶網(wǎng)蛺蝶的幼蟲、蛹和成蟲組成混合樣本(8個家系,80個個體);Gregory等在對不吉按蚊(A.funestus)的表達譜重測序(Denovoexpressionprofiling)的研究中,為了獲得一個覆蓋更廣泛的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集,分別采集了兩個品系不吉按蚊不同生長階段的樣本(每個品系取10個4齡幼蟲、10個蛹,10個雌性成蟲和10個雄性成蟲);Meyer等在珊瑚(A.millepora)轉(zhuǎn)錄組重新測序分析研究時,選擇珊瑚的浮浪幼蟲作為實驗材料,為了增加表達基因的多樣性,研究者將珊瑚的浮浪幼蟲分成兩組進行了不同的溫度處理(28℃和32℃培養(yǎng)5d);Jeukens等利用RocheGS-FLX平臺研究白鮭(C.clupeaformis)的SNP時,為了增加基因型和表達基因的多樣性,采集了24個個體和3種不同的組織(白色肌、腦和肝臟);Kaur等在發(fā)現(xiàn)和驗證豌豆和蠶豆的SSR遺傳標記的研究中,分別采集了其各個生長階段的樣本,包括葉子(幼葉和老葉)、莖、花、未成熟的豆莢、成熟的豆莢和未成熟的種子。由此可知,非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究的樣本采集是一個復(fù)雜的過程,需要研究者根據(jù)不同的研究目的,采集不同的樣本,進行不同的條件處理。2.1.2植物總rna提取研究者根據(jù)自己的研究目的,采集到相應(yīng)的樣本之后,就需要提取樣本中的總RNA。筆者通過文獻查閱,發(fā)現(xiàn)非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究中大部分樣本的總RNA是通過TRIzol試劑(Invitrogen)提取的。當然也有其他方法,但只有少數(shù)運用,例如,李瀅等采用通用植物總RNA提取試劑盒(百泰克公司)提取丹參根總RNA;Parchman等采用CTAB法,可以簡單快速的提取松樹總RNA。此外,用于非模式生物轉(zhuǎn)錄組測序研究的總RNA樣品,要滿足A260/A280在1.9~2.1之間,A260/A230在2.0~2.5之間,以及RNA完整性指數(shù)大于8才能用于后續(xù)的研究。因此在進行下一步cDNA合成之前要對RNA樣品進行DNaseI的處理(37℃,30min)和進一步純化(RNeasyMinEluteCleanupKit,Qiagen)。經(jīng)過DNaseI(RNaseFree)處理并檢測合格的RNA樣品即可用于下一步的cDNA文庫的構(gòu)建。非模式生物轉(zhuǎn)錄組測序中,為了盡可能囊括該物種所有基因,測序的RNA樣品制備中,提取各種組織的總RNA,再將各種組織的總RNA混合成一個樣品,進行高通量測序。2.2cdna開放程度、歸一化過程由于大部分非模式生物從頭轉(zhuǎn)錄組研究采用Roche454技術(shù),以新一代高通量測序平臺Roche454GSFLX為例,其cDNA文庫制備與測序流程簡述如下:(1)從總RNA樣品中提取與純化mRNA,這一過程一般使用mRNA提取試劑盒完成,如OligotexmRNAMinikit(Qiagen);(2)以純化的mRNA為模板合成雙鏈cDNA,并純化合成的cDNA;(3)cDNA片段化,即打斷成400~800bp的片段;(4)cDNA片段的末端補平;(5)在兩個末端連接上A和B接頭(3′和5′端具有特異性);(6)具有A、B接頭的單鏈DNA片段被純化回收后即組成了樣品文庫,至此cDNA文庫制備完成;(7)將單鏈DNA文庫固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上,使大部分磁珠攜帶一個獨特的單鏈DNA片段,然后進行乳液PCR擴增;(8)經(jīng)乳液PCR擴增后,乳液混合物被打破,擴增的片段仍然結(jié)合在磁珠上,攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入“PicoTiterPlate”(PTP)板中進行后續(xù)的測序。另外,在cDNA文庫制備過程中還存在歸一化(Normalization)問題。歸一化過程一般包括cDNA變性與重新組合、DSN(Duplex-specificnuclease)處理以及歸一化片段的擴增。歸一化會降低樣本中高豐度轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量,有利于新基因的發(fā)現(xiàn),并且可以使代表不同轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù)量占總測序讀段的比例增加,有利于SNP的發(fā)現(xiàn)與分析。但是,也有文獻指出,歸一化對基因發(fā)現(xiàn)效率的影響很小,并且歸一化還會消除自然cDNA樣品中基因表達量的差異,以及影響等位基因頻率(標準化傾向于降低常見等位基因頻率)。因此,研究者在進行非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究時,需要根據(jù)自己的研究目的選擇是否進行cDNA文庫的歸一化。2.3數(shù)據(jù)處理與生物信息分析2.3.1序列的東北部組裝對于非模式生物而言,獲得RNA-seq原始數(shù)據(jù)后,首先需要進行序列的從頭組裝,這是后續(xù)研究與分析的基礎(chǔ)。但是,在序列從頭組裝之前,有時還需要根據(jù)測序數(shù)據(jù)情況對其做某些基本的預(yù)處理。例如,數(shù)據(jù)過濾。2.3.2非模式生物轉(zhuǎn)錄組的rna-seq研究在缺乏參考基因組信息的非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究中,獲得RNA-seq原始數(shù)據(jù)后,首先需要將所有測序讀段通過從頭組裝生成重疊群和單一序列,這是后續(xù)處理及生物學(xué)功能分析的基礎(chǔ)。要完成測序讀段的從頭組裝并不簡單,因此,為了有效地做好從頭組裝,目前生物信息學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)出多種組裝程序,包括:GSAssemblerver.1.1.02.15(Roche)、Newbler、MIRA、CAP3、SeqMan、TGICL、stackPACK、Velvet、AbySS、ALLPATHS2、Oases、SOAP-denovo、Multiple-kmethod、Scaffoldingusingtranslationmapping(STM)、Trinity、PCAP。這些從頭組裝程序的開發(fā)和應(yīng)用,密切地配合了高通量DNA測序技術(shù)的實際應(yīng)用,使得非模式生物轉(zhuǎn)錄組的RNA-seq研究得到快速發(fā)展。如表2所示,為近5年來非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究中常用的組裝程序?？梢钥吹?應(yīng)用最為廣泛的是Roche的Newbler,依次是CAP3、MIRA、SeqMan和TGICL,它們都是用于Roche454測序讀段的從頭組裝。而SOAPdenovo、Velvet、Trinity和PCAP則是文獻中報道的用于更短測序讀段(IlluminaGA測序讀段)從頭組裝的常用程序。從頭組裝的目的是生成唯一基因(包括重疊群和單一序列),用于下一步的基因注釋和生物信息學(xué)分析。2.3.3非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫的基因編碼測序讀段通過從頭組裝生成重疊群和單一序列后,通常使用BLAST程序?qū)⑦@些拼接序列唯一基因(重疊群和單一序列)與核酸、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比對(E值<1e-5),選擇匹配最好的一項作為注釋信息。常用于比對的核酸數(shù)據(jù)庫為GenBank非冗余核酸數(shù)據(jù)庫Nt;常用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫則包括Swiss-Prot/UniProtKB、GenBank非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、COG和KEGG。基因注釋一般包括:使用BLASTN與NCBI中的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫Nt進行比對,檢索相似序列,對唯一基因進行注釋;使用BLASTX和BLAST2GO與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Nr和SwissProt)比對,獲得GO信息注釋,并對序列(按分子功能、細胞組分、生物學(xué)過程)進行分類;使用BLASTX與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(COG、KEGG)比對,獲得COG注釋和KEGG代謝途徑注釋。例如用新一代高通量測序技術(shù)IlluminaHiSeqTM2000對紅花(C.tinctoriusL.)轉(zhuǎn)錄組進行測序研究中,Huang等使用BLAST程序(E<1e-5)將紅花唯一基因與核酸數(shù)據(jù)庫(Nt)和蛋白數(shù)據(jù)庫(Nr、SwissProt、KEGG和COG)進行比對,共計注釋了70342條唯一基因,大約占總唯一基因的58%。其中,21943條唯一基因具有COG注釋信息,30203條唯一基因可以匹配到121個KEGG代謝通路。此外,還利用BLAST2GO程序和WEGO軟件對紅花唯一基因進行了GO信息注釋,共計26332條唯一基因匹配到1754個GO-term。2.3.4認識差異表達基因和鑒定控制特定生物學(xué)過程的基因、識別分子在非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究中,利用新一代高通量測序技術(shù)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)除了可以進行以上基因注釋中常見的GO、KEGG和COG分析外,還可以進行大量的其他生物信息學(xué)分析。如基因發(fā)現(xiàn)(Genediscovery)、SNP鑒定[9,11,14,19,34,52,54,59,64,72,76,84,92,97,115]、SSR鑒定[26,41,51,56,60,64,70,72,73,75,92,97]、鑒定差異表達基因、鑒定控制特定生物學(xué)過程的基因、識別可變拼接等。例如,在日本沼蝦(M.nipponense)的轉(zhuǎn)錄組研究中,Ma等在GO、KEGG和COG分析的基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)了許多與性別決定有關(guān)的基因,包括DMRT1、FTZ-F1、FOXL2、FEM1等。除此之外,還利用Mrepssoftware(http://bioinfo.lifl.fr/mreps/)鑒定出6689個SSR,利用VarScan(http://varscan)鑒定出18107個高質(zhì)量SNP。Logacheva等通過比較甜蕎(F.esculentum)和苦蕎(F.tataricum)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,分析了兩者的差異表達基因,這些差異基因包括逆轉(zhuǎn)座子基因以及糖類合成與代謝相關(guān)基因。另外,利用其他信息學(xué)手段還鑒定出許多與蕎麥花序發(fā)育相關(guān)的基因。Huh等在食蟹猴(M.fascicularis)轉(zhuǎn)錄組研究中,分析鑒定出4314個可變剪接事件?？傊?生物信息學(xué)分析是我們分析研究非模式生物轉(zhuǎn)錄組的重要手段,除以上介紹的幾項數(shù)據(jù)分析外,根據(jù)不同的研究目的,我們還可以進行預(yù)測新的開放閱讀框(ORF),確定基因表達豐度,發(fā)現(xiàn)遺傳標記,發(fā)現(xiàn)microRNA等。3非模式生物轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展非模式生物具有許多模式生物缺少的有趣特征,通過非模式生物轉(zhuǎn)錄組的研究可以解答基因進化、遺傳育種以及生態(tài)方面的許多問題。而新一代測序技術(shù)的發(fā)展,從根本上延伸了轉(zhuǎn)錄組研究的范圍,普及到了非模式生物和野生型群體,使之成為了值得期待的研究領(lǐng)域。筆者通過文獻查閱,嘗試對近5年非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究情況進行了簡要匯總,統(tǒng)計了近5年來利用RNA-seq技術(shù)研究的非模式生物物種數(shù)量,并簡要介紹了非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究的一般流程及方法。由于近年來非模式生物