鄭州大學蛋白質(zhì)組全部課件

目錄第一章緒論第二章蛋白質(zhì)組學的研究方法第三章蛋白質(zhì)的提取與分離第四章蛋白質(zhì)組研究中的圖像分析與蛋白譜數(shù)據(jù)庫的建立第五章蛋白質(zhì)的鑒定第六章蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定第七章定量蛋白質(zhì)組學研究技術第八章蛋白質(zhì)組研究中的生物信息學第九章蛋白質(zhì)相互作用研究方法第十章蛋白質(zhì)組學的應用實例第一章緒論

功能基因組與蛋白質(zhì)組1.基因研究是二十世紀生命科學研究的主線生命科學回顧1838Schleiden和Schwann細胞學說1859Darwin物種起源－－進化論1866Mendel孟德爾遺傳定律1870-80sMiesher核酸物質(zhì)－－核素1910-1913Morgen基因理論－－基因連鎖1910Kossel分離出腺嘌呤、胸腺嘧啶和組氨酸1940-50sGriffich和Avery肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗－DNA是遺傳物質(zhì)1953Watson和CrickDNA雙螺旋模型1950sMcClintock跳躍基因1954Crick中心法則1960OchoaRNA聚合酶1961Jacob和Monod乳糖操縱子模型1966Nirenberg遺傳密碼1966GellertDNA連接酶生命科學回顧（續(xù)）1970Smith限制性內(nèi)切酶1970Temin逆轉(zhuǎn)錄酶1972Berg首次DNA重組1977Sanger和Gilbert首次DNA序列分析1981首次獲得轉(zhuǎn)基因動物（小鼠）1983首次獲得轉(zhuǎn)基因植物（煙草）1984人類基因組計劃設想1986基因工程生物（GMO）首次環(huán)境釋放1989美國首次接受GMO的專利申請1994轉(zhuǎn)基因西紅柿作為商品面世1997克隆羊Dolly誕生2001人類基因組框架圖完成

……基因研究是20世紀生命科學的主線20世紀上半葉，DNA雙螺旋結構的提出20世紀下半葉，“中心法則”的問世20世紀90年代，全球性基因組計劃尤其是人類基因組計劃（HGP）的大力推進“后基因組時代”的到來蛋白質(zhì)組學基因組計劃？

2.基因組計劃1986年，人類基因組計劃（HGP）于首次在Science雜志發(fā)表的一篇文章中提出.其目的是闡明人類基因組30億個堿基對的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并闡明其在染色體上的位置，從而在整體上破譯人類遺傳信息。該計劃啟動于1990年，原定15年完成，由于技術的成熟與基因組測序的規(guī)模化運作，以及來自商業(yè)競爭方面的壓力，2000年6月26日基因組序列草圖測序完成。遺傳圖物理圖序列圖基因組計劃1/2ofallgenes“identified”havenoknownfunction這三條數(shù)據(jù)將提供此生物所有基因在染色體上的精確定位、基因內(nèi)部序列以及基因的間隔序列。

原核生物或低等真核生物。

人類基因組以及多種模式生物、重要生物基因組全序列的完成，標志著生命科學研究進入所謂的“后基因組時代(Postgenomeera)”,即產(chǎn)生了功能基因組學（FunctionalGenomics）轉(zhuǎn)錄組學蛋白質(zhì)組學代謝組學表型組學相互作用組學

……功能基因組學功能基因組學采用一些新的技術，如轉(zhuǎn)錄組學應用微陣列(Microarray)、DNA芯片(DNAchip）及SAGE(Serialanalysisofgeneexpression)等技術，可對成千上萬的基因表達進行分析比較，并從基因整體水平上對基因的活動規(guī)律進行闡述，力求從細胞水平上解決基因組問題，以建立對生命現(xiàn)象的整體認識。蛋白質(zhì)組學是后基因組學時代研究的中心，而以闡明生物體內(nèi)蛋白質(zhì)表達模式與功能模式為目標的蛋白質(zhì)組學成為功能基因組學研究的重要內(nèi)容之一。3.蛋白質(zhì)組學的提出蛋白質(zhì)組(proteome)：

PROTEOME=PROTEin+genOME澳大利亞學者Wilkins和Williams首次提出，意旨“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”。Swinbanks認為“proteome”代表一完整生物的全套蛋白質(zhì)。KahnP認為“proteome”反映不同細胞的不同蛋白質(zhì)組合?！皃roteome”三種不同的含義：一個基因組、一種生物或一種細胞/組織所表達的全套蛋白質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)組的提出，蛋白質(zhì)組學(Proteomics)也自然而然地孕育產(chǎn)生。

蛋白質(zhì)組學是研究蛋白質(zhì)或應用大規(guī)模蛋白質(zhì)分離和識別技術研究蛋白質(zhì)組的一門學科，是對基因組所表達的整套蛋白質(zhì)的分析。蛋白質(zhì)組學可以被廣泛定義為生物樣本中蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析與存檔，闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測、細胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能網(wǎng)絡。蛋白質(zhì)組學的誕生實質(zhì)上是依賴于基因組測序計劃的成功，該計劃雖未對揭示生物體的本質(zhì)提供更多的信息，但是它為更加廣泛而有效的實驗方法的產(chǎn)生提供了基本的平臺，而這些實驗方法將為鑒定基因組編碼的基因，并最終理解這些基因產(chǎn)物在生命活動中的調(diào)控作用提供支撐。蛋白質(zhì)組學與基因組學的聯(lián)系蛋白質(zhì)組與基因組相對應，也是一個整體的概念，是基因組表達的全部蛋白。但兩者又有根本的不同之處。

4.蛋白質(zhì)組學與基因組學的聯(lián)系與區(qū)別同一個體的基因組不論是在不同的發(fā)育階段或不同種類的細胞里都是一樣的；對于不同類型的細胞或同一個細胞在不同的生理狀態(tài)下，蛋白質(zhì)組的構成是不同的；基因組蛋白組多樣性同一性蛋白質(zhì)組學與基因組學的區(qū)別基因組蛋白組

有限性無限性基因組無論大小，其核苷酸的數(shù)量和序列是一定的，例如人類基因組長度為32億個堿基對；對基因組序列的測定是一種“有限”的工作。由于細胞內(nèi)大部分蛋白質(zhì)存在翻譯后修飾，包括磷酸化、糖基化、?；?，很難確定蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)數(shù)量；對蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)種類的確定是一種“無限”的工作?；蚪M蛋白組靜態(tài)動態(tài)一個個體的基因組自個體誕生到死亡，始終保持不變；個體的蛋白質(zhì)組，作為新陳代謝的主要執(zhí)行者，在個體的生命活動中卻總是變動的；蛋白質(zhì)組學研究的一個重要任務是找出蛋白質(zhì)組里發(fā)生變化的蛋白質(zhì)。基因組蛋白組

周期性空間性基因組通常位于細胞核內(nèi)，比較穩(wěn)定，序列和功能一般不受空間的影響，但是在發(fā)育的不同階段和不同的細胞周期，mRNA的表達是不一樣的；不同的蛋白質(zhì)分布在細胞的不同部位，它們的功能與其空間定位密切相關；許多蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)不是靜止的，他們常常在不同的亞細胞環(huán)境里運動而發(fā)揮作用；細胞的信號傳導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控也常常依賴于蛋白質(zhì)的變化和運動?；蚪M蛋白組孤立行為相互作用基因組表達的各種mRNA是彼此孤立的，互不干擾；蛋白質(zhì)組中的各種蛋白質(zhì)卻是彼此間有著廣泛的相互作用；蛋白質(zhì)互作的研究有兩類：第一類是研究蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡，第二類是研究蛋白質(zhì)復合體組成?；蚪M蛋白組單一手段多種技術在基因組研究中，DNA測序技術是最基本和最主要的工具，因為基因組的均一性和簡單性使得一種單一的技術就能勝任基因組的研究任務。在蛋白質(zhì)組研究中，需要的研究技術遠遠不止一種，并且技術的難度也遠遠大于基因組的研究技術；蛋白質(zhì)組研究技術可以簡單地分為兩大類：蛋白質(zhì)組分離技術，蛋白質(zhì)組的鑒定技術，其核心是質(zhì)譜技術。蛋白質(zhì)組學與基因組學研究互補與互助在質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)的過程中，離不開對已知基因組的基因數(shù)據(jù)的比較；蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)可以幫助大大提高基因注釋的正確率。5.WhyProteomics?Compartmentalization：區(qū)分、劃分Proteolysis：蛋白水解

2001年，人類基因組序列圖譜初稿的公布。但是，基因只是遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)才是生物細胞賴以生存的各種代謝和調(diào)控途徑的主要執(zhí)行者。而這僅僅是基因水平的差別，2001年，人類基因組序列圖譜初稿的公布，但是，基因只是遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)才是生物細胞賴以生存的各種代謝和調(diào)控途徑的主要執(zhí)行者。而蛋白質(zhì)的差別也比基因差別更大，生物間蛋白質(zhì)數(shù)的差別

基因數(shù)差別×101-3蛋白質(zhì)組可能是生物復雜性進化的基礎“失之毫厘，差之千里”因此，生物間蛋白質(zhì)數(shù)的差別約是基因數(shù)差別的10到1000倍，可謂是：“失之毫厘，差之千里”，因此，蛋白質(zhì)組可能是生物復雜性進化的基礎。翻譯后修飾相互作用構象變化翻譯后拼接移位胞質(zhì)胞核蛋白質(zhì)的多樣性而作為生命的執(zhí)行者，蛋白質(zhì)又具有多樣性，可謂是生命的萬花筒。比如它可以經(jīng)過翻譯后修飾的到不同作用的蛋白質(zhì)；然后經(jīng)過相互作用與不同的蛋白或者其他分子形成功能復合體。而不同的構象則直接影響蛋白質(zhì)的功能；此外經(jīng)過翻譯后拼接，不同蛋白質(zhì)還可以成為融合蛋白，然后移位到合適的位置進一步發(fā)揮功能。（1）從mRNA表達水平并不能預測蛋白表達水平用基因表達連續(xù)分析法研究對數(shù)生長期啤酒酵母的80個基因,結果沒有發(fā)現(xiàn)翻譯和轉(zhuǎn)錄豐度有明顯相關;對某些基因,相同的mRNA豐度翻譯成蛋白的量的差異可達50倍;而相等的蛋白量可由豐度相差40倍的mRNA轉(zhuǎn)錄而來。這說明轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對蛋白的含量有幾乎相同的重要性WhyProteomics?（2）蛋白質(zhì)的動態(tài)修飾和加工并非必須來自基因序列蛋白質(zhì)在翻譯后有多種化學修飾,如糖基化、磷酸化、異戊二烯化、?；饔玫?。蛋白質(zhì)在翻譯后還有各種加工過程，如剪切（酶原降解、結構域拼接）等，不但可以改變其立體結構，而且是實施其功能與調(diào)節(jié)的重要結構基礎。WhyProteomics?(3)蛋白質(zhì)組動態(tài)地反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)細胞周期的特定時期、分化的不同階段、對應的生長和營養(yǎng)狀況、溫度、應激和病理狀態(tài)等其相應的蛋白質(zhì)組之間存在差異。對其中蛋白質(zhì)合成、降解、加工、修飾的調(diào)控過程,只有通過蛋白質(zhì)的直接分析才能提示。WhyProteomics?

由此可見，基因雖然是遺傳信息的源頭，而功能性蛋白卻是基因功能的執(zhí)行體?；蚪M計劃的實現(xiàn)固然為生物有機體全體基因序列的確定，為未來生命科學研究奠定了堅實的基礎，但是卻不能夠告訴人們那些基因在何時何地以何種程度表達，也就是說基因組它并不能直接提供認識各種生命活動的分子基礎，其間必須研究生命活動的執(zhí)行體-蛋白質(zhì)這一重要環(huán)節(jié)。

蛋白質(zhì)組的研究應運而生！WhyProteomics?6.蛋白質(zhì)組學的研究意義蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)結構和功能研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。幾乎所有的生理和病理過程，以及藥物和環(huán)境因子的作用都依賴于蛋白質(zhì)，并引起蛋白質(zhì)的變化。反之，對蛋白質(zhì)組變化的分析也能提供對上述過程或結果的重要信息。蛋白質(zhì)組學的研究手段也可以應用于農(nóng)業(yè)研究、環(huán)境保護等多方面。蛋白質(zhì)組研究不僅可實現(xiàn)與基因組的對接與確認，直接揭示生命活動規(guī)律和本質(zhì)、人類重大疾患（病原體）致病的物質(zhì)基礎以及發(fā)生與發(fā)展的病理機制；而且可廣泛推動生命科學基礎學科以及分析、信息、材料等應用科學的發(fā)展；對提高我國生物醫(yī)學原始創(chuàng)新能力、重大疾病防診治能力和國民健康水平以及新藥研發(fā)能力、對促進生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)乃至國民經(jīng)濟的發(fā)展具有重大的戰(zhàn)略意義7.蛋白質(zhì)組學的研究內(nèi)容

了解某種特定的細胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類；

明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡的；

描繪蛋白質(zhì)的精確三維結構，揭示其結構上的關鍵部位，如與藥物結合并且決定其活性的部位。在蛋白質(zhì)水平上定量、動態(tài)、整體地研究生物體，旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式。蛋白質(zhì)組表達模式ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomics蛋白質(zhì)組功能模式

Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes蛋白質(zhì)組研究包括兩個方面：

1）表達蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)表達譜（組織、器官、細胞、亞細胞分布等）

2）比較蛋白質(zhì)組學比較不同蛋白質(zhì)組的差異與相似性；

3）結構蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)三維結構的解析(X-ray/NMR/modelling)；

4）功能蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)的功能和相互作用；

5）蛋白質(zhì)組學研究的技術平臺與生物信息學

分離、鑒定技術，分析軟件和數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)組學的分類8.蛋白質(zhì)組學的研究技術與路線蛋白質(zhì)分離技術凝膠雙向電泳、HPLC；蛋白質(zhì)鑒定技術

Edman測序、質(zhì)譜技術；圖像分析與生物信息技術圖像分析軟件，數(shù)據(jù)庫；相互作用研究技術酵母雙雜交技術、免疫共沉淀、蛋白質(zhì)芯片等。蛋白質(zhì)組研究的宗旨－－將組織或細胞所有蛋白質(zhì)（至少是大部分）分離與鑒定蛋白質(zhì)組的技術基礎（三大支撐技術）雙向凝膠電泳為主的蛋白質(zhì)分離技術（使數(shù)以千計的蛋白得到有效的分離）質(zhì)譜技術為主的蛋白質(zhì)鑒定技術（精確測定生物大分子相對質(zhì)量及多肽序列）計算機為基礎的圖像分析及相應數(shù)據(jù)庫分析

蛋白質(zhì)組學研究的手段蛋白質(zhì)組研究的核心———分離技術(Separation)蛋白質(zhì)組的百科全書———數(shù)據(jù)庫(Database)

蛋白質(zhì)組研究的支柱———鑒定技術(Identication)蛋白質(zhì)組技術的規(guī)模———高流通量篩選(HTS)蛋白質(zhì)研究基本路線：

樣品制備與分離圖像分析蛋白質(zhì)成分的分析與鑒定數(shù)據(jù)庫檢索9.國內(nèi)外蛋白質(zhì)組學研究現(xiàn)狀A.發(fā)展速度與規(guī)模

研究論文數(shù)量上從1995年的1篇，到2004年的8000多篇。參與的國家從1995年的澳大利亞，到97年的美國、丹麥、瑞士等10個國家。各國政府支持，國際著名研究和商業(yè)機構加盟：1996年澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質(zhì)組研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）美國國立癌癥研究院（NCI）投資1000萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。NCI和FDA共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。英國建立三個蛋白質(zhì)組研究中心對已完成或即將完成全基因組測序的生物體進行蛋白質(zhì)組研究。B.

發(fā)展進展

Celera公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定和分類匯總人類組織、細胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構體，構建新一代的蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)庫的工作。

1997年召開了第一次國際“蛋白質(zhì)組學”會議

1998年在美國舊金山召開了第二屆國際蛋白質(zhì)組學會議

1999年1月在英國倫敦舉行了應用蛋白質(zhì)組會議

人類蛋白質(zhì)組正式啟動2001年成立國際人類蛋白質(zhì)組組織（HUPO），2003.12.15啟動兩個首批行動計劃人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃（HLPP）：由中國軍事醫(yī)學科學院副院長賀福初院士領導，16國80多個實驗室參加。中國第一次領導重大國際協(xié)作計劃。人類血漿蛋白質(zhì)組計劃（HPPP）：由美國科學家牽頭，13國47個實驗室參加。蛋白質(zhì)的基本組成單位氨基酸及其連接方式蛋白質(zhì)的一級、二級、三級、四級結構，模體、結構域蛋白質(zhì)一級結構與空間結構和功能的關系蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其提取、純化的原理蛋白質(zhì)氨基酸序列和空間結構的測定第二章

蛋白質(zhì)的結構與功能二、蛋白質(zhì)的生物學重要性1.蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分

蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。1）作為生物催化劑2）代謝調(diào)節(jié)作用3）免疫保護作用4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞2.蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能3.氧化供能組成蛋白質(zhì)的元素：主要有C

(50%-55%)、H(6%-8%)、O(19%-24%)、N(13%-19%)和S(0-4%)；有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷，鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘。第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成

各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。

由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%蛋白質(zhì)元素組成的特點一、氨基酸—蛋白質(zhì)的基本單位存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬L-α-氨基酸（甘氨酸除外）。氨基酸的化學結構具有共同的特點：碳原子上除連接1個羧基，還有1個氨基，故稱為α-碳原子。此外還有1個側鏈（R基團）。1.非極性疏水性氨基酸：在水中溶解度較小包括：

帶有脂肪烴側鏈氨基酸（丙、纈、亮、異亮）含芳香環(huán)的氨基酸（苯丙）含硫氨基酸（甲硫）亞氨基酸（脯）及甘氨酸（一）氨基酸的分類根據(jù)側鏈R基團的結構和理化性質(zhì)可分為四類：甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00纈氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98

異亮氨酸

isoleucineIleI

6.02

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非極性疏水性氨基酸

含有具有一定極性的R基團，在水中溶解度較非極性疏水性氨基酸大。包括：有羥基的氨基酸（絲、蘇）有酰胺基的氨基酸（谷氨酰胺、天冬酰胺）含巰基的氨基酸（半胱）芳香族氨基酸（酪、色）2.極性中性氨基酸：色氨酸

tryptophanTryW

5.89絲氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTryY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

蘇氨酸

threonineThrT5.602.極性中性氨基酸

有兩個羧基，在生理條件下帶負電荷。包括：天冬氨酸和谷氨酸

3.酸性氨基酸4.堿性氨基酸

在生理條件下帶正電荷。包括：側鏈含ε-氨基的賴氨酸

R基團含一個帶正電荷胍基的精氨酸

R基團含一個弱堿性咪唑基的組氨酸

天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22賴氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76組氨酸

histidineHisH

7.593.帶負電荷的酸性氨基酸4.帶正電荷的堿性氨基酸幾種特殊氨基酸

脯氨酸（亞氨基酸）

半胱氨酸

+胱氨酸二硫鍵-HH(二)氨基酸的理化性質(zhì)1.物理性質(zhì)

都是白色晶體，熔點較高。能溶于強酸和強堿溶液；在水中的溶解度各不相同。2.兩性解離與等電點氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離方式取決于所處溶液的酸堿度。

兩性解離及等電點所有的氨基酸都含有堿性的α-氨基（或亞氨基）和酸性的α-羧基，可在酸性溶液中與質(zhì)子（H+）結合成帶正電荷的陽離子，也可在堿性溶液中失去質(zhì)子變成帶負電荷的陰離子，因此氨基酸是一種兩性電解質(zhì)，具有兩性解離的特性。氨基酸在溶液中的解離方式取決于其所處溶液的酸堿度。

等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。

氨基酸的等電點由α-氨基、α-羧基和R基團的解離狀態(tài)共同決定。

pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子3.紫外吸收

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸由于含有共軛雙鍵，在280nm

附近有最大吸收峰。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有酪氨酸和色氨酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收值是蛋白定量的快速簡便方法。芳香族氨基酸的紫外吸收4.茚三酮反應

氨基酸與茚三酮的水合物共熱，氨基酸被氧化分解，茚三酮水合物則被還原。在弱酸性溶液中，茚三酮的還原產(chǎn)物與氨基酸分解產(chǎn)生的氨及另一分子茚三酮縮合成為藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。藍紫色化合物顏色的深淺與氨基酸分解產(chǎn)生的氨成正比，據(jù)此可進行氨基酸定量分析。二、肽*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的

-羧基與另一個氨基酸的

-氨基脫水縮合而形成的酰胺鍵。（一）肽(peptide)與肽鍵（peptidebond）*肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……*

肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。*由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。命名、編號多肽的命名：從N末端開始指向C末端主鏈：α-碳原子和肽鍵的若干重復結構側鏈：各氨基酸殘基的側鏈基團

一級結構(primarystructure)—基本結構二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)高級或空間結構蛋白質(zhì)的分子結構包括蛋白質(zhì)是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接形成的具有特定分子結構的高分子化合物。第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結構

定義蛋白質(zhì)的一級結構指多肽鏈中氨基酸的種類、數(shù)目及排列順序。一、蛋白質(zhì)的一級結構主要的化學鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。一級結構是蛋白質(zhì)空間構象和特異生物學功能的基礎，但不是決定蛋白質(zhì)空間構象唯一因素。二、蛋白質(zhì)的二級結構蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象。定義

主要的化學鍵：

氫鍵

蛋白質(zhì)二級結構的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉(zhuǎn)角(

-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

（一）

-螺旋螺旋狀肽鏈立體結構

多個肽鍵平面通過α-碳原子旋轉(zhuǎn)，相互之間緊密盤曲成穩(wěn)固的右手螺旋；相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中C=O和NH形成許多鏈內(nèi)氫鍵；肽鏈中氨基酸側鏈R分布在螺旋的外側，其形狀、大小及電荷影響α-螺旋的形成。α-螺旋的結構特點：

（二）

-折疊肽鏈平面之間折疊成鋸齒狀，R側鏈伸出在鋸齒的上方或下方；依靠肽鏈間的C=O與NH形成氫鍵，使構象穩(wěn)定；兩段肽鏈可以是平行的，也可以是反平行的。β-折疊的結構特點：

（三）

-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲

-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。肽鏈180°回折角處的構象；第1個氨基酸的C=O與第

4個氨基酸的NH形成氫鍵；第2個氨基酸：脯氨酸；球狀蛋白質(zhì)分子表面（四）超二級結構/模體在許多蛋白質(zhì)分子中，相互臨近的二級結構常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級結構聚集體，被稱為超二級結構（supersecondarystructure)，又稱模體(motif)。

超二級結構的基本形式：

αα、ββ、βαβ三、蛋白質(zhì)的三級結構疏水鍵、鹽鍵、氫鍵和范德華力等。疏水鍵是維持三級結構穩(wěn)定的最主要作用力。主要的化學鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）定義

結構域大分子蛋白質(zhì)的三級結構?？煞指畛梢粋€或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結構域(domain)。

由一條多肽鏈形成的蛋白質(zhì)，其最高級結構為三級結構。只有具有三級結構的蛋白質(zhì)才具有生物學活性。

亞基之間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和鹽鍵。四、蛋白質(zhì)的四級結構蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結構。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。單獨的亞基一般沒有生物學功能，只有完整的四級結構才具有生物學功能。單獨的亞基一般沒有生物學功能，只有完整的四級結構才具有生物學功能。五、蛋白質(zhì)的分類

*根據(jù)蛋白質(zhì)的分子組成

單純蛋白質(zhì)結合蛋白質(zhì)=單純蛋白質(zhì)+非蛋白質(zhì)部分*根據(jù)蛋白質(zhì)形狀和空間構象

纖維狀蛋白質(zhì)：長軸:短軸＞10，不溶于水球狀蛋白質(zhì)：長軸:短軸＜10，水溶性較好（輔基）（一）一級結構是空間構象的基礎

一、蛋白質(zhì)一級結構與功能的關系

蛋白質(zhì)結構與功能的關系

第三節(jié)分子伴侶分子伴侶(chaperon)通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質(zhì)折疊成天然構象。*分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。*分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。*分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。（二）一級結構是功能的基礎相似的一級結構具有相似的功能不同種屬來源的胰島素都有調(diào)節(jié)血糖的功能一級結構：A、B兩條多肽鏈、氨基酸序列相差甚微二硫鍵分布相同對蛋白質(zhì)一級結構的比較可以反映分子的進化細胞色素c的一級結構：人類與黑猩猩：完全相同；與獼猴：相差1個氨基酸；人類與面包酵母：相差51個氨基酸。（三）一級結構改變與分子病例：鐮刀形紅細胞貧血

這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)根本原因：編碼多肽鏈的基因的堿基序列發(fā)生改變一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點

1.蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)分子中可解離的基團多肽兩端游離的α-氨基和α-羧基多肽側鏈R上解離的基團

決定蛋白質(zhì)解離成正負離子的因素蛋白質(zhì)所含酸性和堿性基團的數(shù)目蛋白質(zhì)所在溶液的pH值第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

2.蛋白質(zhì)的等電點（pI）

當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)等電點性質(zhì)為電泳分離的依據(jù)。

NH2COO-PrNH3+COOHPrNH3+COO-OH-H+Pr(pH＜pI)(pH＝pI)(pH＞pI)蛋白質(zhì)的陽離子蛋白質(zhì)的兼性離子蛋白質(zhì)的陰離子OH-H+蛋白質(zhì)也是兩性電解質(zhì)，在堿性溶液中表現(xiàn)出帶負電荷，在酸性溶液中表現(xiàn)出帶正電荷，在某一定PH溶液中，蛋白質(zhì)所帶的正電荷和負電荷相等時的PH,稱為該蛋白的等電點。

體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點在pH5.0左右，因而在生理條件下以陰離子形式存在。3.電泳

帶電粒子在電場中向電性相反的電極移動的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)在帶電場中泳動的速度和方向與其所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及分子的大小、形狀有關。帶電荷多，分子小的泳動速度較快；反之則泳動較慢，從而達到分離蛋白質(zhì)的目的。

二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

1.蛋白質(zhì)有膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)是生物大分子，分子量在1萬～10萬Da之間，分子直徑在膠體顆粒的范圍（1~100nm），因此，蛋白質(zhì)具有膠體的性質(zhì)。

2.蛋白質(zhì)親水膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)分子表面的水化膜和同種電荷。去掉兩個穩(wěn)定因素，則蛋白質(zhì)從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。

3.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應用

透析用于分離純化蛋白質(zhì)

超速離心用于蛋白質(zhì)的分離純化及分子量的測定。變性的概念

在某些物理或化學因素的作用下，蛋白質(zhì)特定的空間構象被破壞，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性。變性的實質(zhì)次級鍵斷裂，空間結構破壞

三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固蛋白質(zhì)變性的應用

應用變性的因素進行消毒、滅菌。保存生物制劑則要防止蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)的復性：大多數(shù)蛋白質(zhì)變性后，空間構象嚴重破壞，不能恢復其天然狀態(tài)，稱為不可逆性變性；若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素，有些可恢復其天然構象和生物活性,稱為蛋白質(zhì)的復性。

蛋白質(zhì)沉淀概念：蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀。方法：鹽析法、有機溶劑的沉淀、重金屬鹽沉淀、生物堿試劑沉淀。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，但不一定都發(fā)生沉淀。沉淀的蛋白質(zhì)易發(fā)生變性，但并不都變性，如鹽析。四、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基，具有紫外吸收能力，在280nm處有最大吸收峰。此特性常用于蛋白質(zhì)含量的測定。五、蛋白質(zhì)的免疫學性質(zhì)蛋白質(zhì)作為大分子，往往具有免疫原性，同時，抗體也是蛋白質(zhì)?？乖庖咴悍材艽碳C體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答，并能與相應抗體或致敏淋巴細胞受體發(fā)生特異性結合的物質(zhì)?？贵w：機體中因抗原刺激而產(chǎn)生的能與相應抗原特異結合并具免疫功能的免疫球蛋白。單克隆抗體：由針對某一個特定抗原決定簇而分化、增殖而來的B淋巴細胞群合成并分泌的抗體。六、蛋白質(zhì)的呈色反應1.雙縮脲反應：肽鍵與雙縮脲試劑反應呈紫色；氨基酸無此反應，可用于檢查蛋白質(zhì)的水解程度。堿性溶液中與Cu2+產(chǎn)生藍色，mg級測定2.茚三酮反應:酸性條件下，與茚三酮共熱產(chǎn)生藍紫色3.Folin—酚試劑反應堿性+Cu2++磷鉬酸-磷鎢酸→藍色范圍:25-250μg(Tyr,Trp的反應)1.紫外分光光度法:280nm,0.1-0.5mg/ml(樣品含核酸時)蛋白質(zhì)(mg/ml)=1.55A280-0.75A2602.福林-酚試劑法:堿性+Cu2++磷鉬酸-磷鎢酸→藍色范圍:25-250μg(Tyr,Trp的反應)七、蛋白質(zhì)的含量測定3.雙縮脲（Biuret）法：蛋白質(zhì)+堿性+Cu2++BCA試劑(4,4‘-二羧酸-2,2’-二喹啉鈉)→紫色(562nm)范圍:10-1200μg/ml4.Bradford蛋白分析法:考馬斯亮藍G-250+乙醇+酸性→淡紅色+蛋白質(zhì)→藍色(595nm)范圍:10-100μg/ml（三）蛋白質(zhì)空間結構改變與疾病

蛋白質(zhì)構象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質(zhì)的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)的分離純化

第五節(jié)TheSeparationandPurificationofProtein一、蛋白質(zhì)的提取1.選材：新鮮、富含目的蛋白且來源方便2.組織細胞的粉碎：胞內(nèi)及膜中蛋白物理法：如超聲、勻漿、加砂研磨、高壓擠壓等化學法：如EDTA、SDS等酶法：如自溶法、外加酶法（纖維素酶、果膠酶、溶菌酶等）3.提?。哼m當溶媒、適當條件、適當提取時間和次數(shù)二、蛋白質(zhì)的分離純化（一）根據(jù)溶解度不同（二）根據(jù)分子大小不同（三）根據(jù)電離性質(zhì)不同（四）根據(jù)配基特異性（一）根據(jù)溶解度不同1.等電點沉淀:蛋白質(zhì)在pI時溶解度最小2.鹽析(分級):大量中性鹽如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白質(zhì)溶液中,破壞蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素而沉淀.各種蛋白質(zhì)鹽析時需鹽濃度及pH不同.3.低溫有機溶劑沉淀(分級):降低水的介電常數(shù)（二）根據(jù)分子大小不同1.透析和超濾(分級):根據(jù)分子量的大小，用透析袋或濾膜將大、小分子物質(zhì)分開2.凝膠過濾(分子排阻層析):又稱分子篩，柱內(nèi)填滿帶有小孔的顆粒，一般為葡聚糖3.密度梯度離心:根據(jù)粒子密度差進行分離。蔗糖,CsCl(三)根據(jù)電離性質(zhì)不同1.電泳法:蛋白質(zhì)泳動的方向和速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及質(zhì)點的大小和形狀

1)醋酸纖維素薄膜電泳

2)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)3)等電聚焦電泳

4)免疫電泳2.離子交換層析（如下頁圖）

1)離子交換纖維素

2)離子交換凝膠

3)大孔型離子交換樹脂離子交換層析（IonExchangeChromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換凝膠和離子交換樹脂。離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點，當?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結合帶有負電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

(四)根據(jù)配基特異性親和層析:

根據(jù)生物大分子與其配基間特異的親和結合(可逆)將具有特殊結構的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開，然后選用適當?shù)南疵撘?，改變結合條件將被結合的蛋白質(zhì)洗脫下來，這種分離純化蛋白質(zhì)的方法稱為親和層析。親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結合，而這種結合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應抗體（或抗原）選擇性地結合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達到分離提純的目的。此法具有高效、快速、簡便等優(yōu)點。三、蛋白質(zhì)的純度鑒定1.層析法:單一洗脫峰→層析純(HPLC)2.電泳法:單一區(qū)帶→電泳純高效毛細管電泳(HPCE)3.免疫化學法:→免疫純化放射免疫分析法(RIA)

酶標記免疫分析法(ELISA)四、多肽鏈中氨基酸序列分析分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果。多肽N-末端氨基酸殘基的測定Sanger法（二硝基氟苯反應）

DNFB可與氨基酸的α-氨基反應多肽離末端氨基+DNFBDNP-多肽

DNFB與氨基形成的鍵對酸水解比肽鍵穩(wěn)定只有N-末端氨基酸為黃色DNP-氨基酸衍生物其余是游離氨基酸

DNS法（丹磺酰氯反應）

原理與DNFB法相同。丹磺酰基有熒光，靈敏高。

Edman法（苯異硫氰酸脂反應）

氨肽酶法

肼解法是目前測定C-末端殘基的重要化學方法多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解，反應中除C-末端氨基酸以游離形式存在外，其它氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳陌被狨ｋ禄铩?/p>

還原法羧肽酶法多肽N-末端氨基酸殘基的測定通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質(zhì)的基因測定DNA序列排列出mRNA序列五、蛋白質(zhì)空間結構測定*二級結構測定通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結構含量。

-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198nm處的正峰三個成分；而

-折疊的CD譜不很固定。*三級結構測定X射線衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技術(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結構最準確的方法。*用分子力學、分子動力學的方法，根據(jù)物理化學的基本原理，從理論上計算蛋白質(zhì)分子的空間結構。根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預測其三維空間結構*通過對已知空間結構的蛋白質(zhì)進行分析，找出一級結構與空間結構的關系，總結出規(guī)律，用于新的蛋白質(zhì)空間結構的預測。蛋白質(zhì)研究方法的概述大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術高通量蛋白質(zhì)鑒定技術第三章蛋白質(zhì)組研究方法

第一節(jié)蛋白質(zhì)研究方法的概述一、蛋白質(zhì)組的研究遠比基因組的研究要復雜的多

蛋白質(zhì)的數(shù)目遠大于基因的數(shù)目：基因的拼接和翻譯后修飾蛋白質(zhì)是動態(tài)/基因是相對靜態(tài)的氨基酸種類遠多于核苷酸種類技術手段上：基因研究有PCR、DNA自動測序技術、DNA微陣列技術等；蛋白質(zhì)沒有相匹配的技術DNA蛋白質(zhì)檢測水平/靈敏度可用PCR技術擴增檢測限約為30個拷貝/樣本無法被擴增檢測方法高度特異DNA與其互補序列（DNA/RNA）的雜交能力使得DNA很容易固相化在靶上并用熒光探針檢測。高密度陣列檢測專用的掃描儀已經(jīng)出現(xiàn)非特異蛋白質(zhì)可以用非特異的方法如蛋白染色或較特異的方法如抗體進行檢測分子的穩(wěn)定性DNA是非常穩(wěn)定的，即使在提高溫度的情況下也不丟失生物活性蛋白質(zhì)變性后將喪失天然功能，需要格外小心保持其天然構象重復性重復性好將DNA固相化在表面已經(jīng)是成熟的技術，加之DNA固有的穩(wěn)定性，方法的重復性較好重復性不好由于蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性不好，方法的重復性需格外關注消耗初始的投入是較大的（微陣列、掃描儀、共聚焦顯微鏡），但短期內(nèi)得到的數(shù)據(jù)量相當大目前的蛋白質(zhì)分析方法依賴昂貴的儀器設備（質(zhì)譜儀、2-DE裝置）專業(yè)化方法已相當標準化蛋白質(zhì)的分析較困難。大部分分析工作如純化與質(zhì)譜分析等都需要受過訓練的人員來操作時間自動化已成為高通量的掃描技術還不能達到工業(yè)需求的高通量翻譯后修飾無法研究研究翻譯后修飾的唯一方法是研究蛋白質(zhì)本身動態(tài)范圍5個數(shù)量級7-12個數(shù)量級DNA分析（cDNA微陣列）與蛋白質(zhì)分析（2-DE與質(zhì)譜）方法的比較二、蛋白質(zhì)研究技術的發(fā)展雙向電泳技術：1975年，O’Farrel建立的；是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離與展示的分離技術，一般能分離1000–3000個蛋白質(zhì)點圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理軟件：分析蛋白質(zhì)圖譜并建立相應的數(shù)據(jù)庫兩種軟電離質(zhì)譜技術－基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS）與電噴霧電離質(zhì)譜（electro-sprayionizationmassspectrometry,

ESI-MS）：可精確測定生物大分子的相對分子質(zhì)量及多肽序列，使得微量快速的蛋白質(zhì)鑒定得以實現(xiàn)。雙向電泳技術質(zhì)譜技術計算機圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術蛋白質(zhì)組研究的三大基本支撐技術三、蛋白質(zhì)組研究的步驟2-D電泳分離蛋白質(zhì)，得到蛋白質(zhì)表達譜。氨基酸組成分析、C-端或N-端氨基酸序列分析及MS鑒定所分離的蛋白質(zhì)生物信息學數(shù)據(jù)庫對鑒定結果進行存儲、處理、對比和分析蛋白質(zhì)組研究的策略和基本技術路線凝膠中的蛋白膠上原位酶切蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)樣品的制備（細胞、組織、體液）雙向電泳圖像分析、數(shù)據(jù)處理電轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白混合肽氨基酸分析、氨基酸組成Edman降解、N端測序肽序列標簽肽質(zhì)量指紋圖數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)鑒定MALDI-TOF-MSESI-MS-MS寡核苷酸合成基因蛋白實驗蛋白活性免疫組化蛋白定位抗體肽合成四、新的蛋白質(zhì)組研究技術定量蛋白質(zhì)組學研究：同位素編碼親和標簽技術（isotope-codedaffinitytags,ICAT）和雙色熒光技術等蛋白質(zhì)相互作用：酵母雙雜交技術、蛋白質(zhì)復合物免疫分離與質(zhì)譜鑒定技術；蛋白質(zhì)分離與鑒定：多維色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術翻譯后修飾：蛋白質(zhì)圖譜展示與檢測技術蛋白質(zhì)表達：蛋白質(zhì)芯片技術蛋白質(zhì)組學的目的：實現(xiàn)對一個基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)及其相互作用的研究首要問題：蛋白質(zhì)的有效分離理想的蛋白質(zhì)分離方法：超高分辨率；可針對不同類型的蛋白質(zhì)第二節(jié)大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術一、二維凝膠電泳（2D）二、色譜－質(zhì)譜技術三、一維電泳（色譜）－質(zhì)譜技術1.1原理：在相互垂直的兩個方向上，分別基于蛋白質(zhì)等電點和相對分子量的不同將蛋白質(zhì)分離。一、二維凝膠電泳（2D）1.二維凝膠電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis，2D）是目前唯一能夠?qū)?shù)千種蛋白同時分離與展示的技術。2D是1975年由O’Farrell和Klose分別提出的。第一向進行等電聚焦（isoelectricfocusing,IEF）,由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進行電泳時，會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當?shù)鞍走w移至其等電點pH位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的pH梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常使用預制膠條（IPG）用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的IPG膠條在含有SDS的緩沖液中平衡第二向是將在IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到SDS凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量大小與第一向相垂直的分離。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息1.2固相化pH梯度（immobilizedpHgradient,IPG）等電聚焦電泳技術；微量鑒定技術以及質(zhì)譜技術靈敏度的提高；1.3不足：膜蛋白、堿性蛋白、低豐度蛋白的分離與檢測；重復性以及規(guī)模化和自動化的問題等；1.4改進：2-DE樣品的預處理；2-DE后的蛋白點的檢測研究等。2.低豐度蛋白、膜蛋白的檢測與樣品預分離2.1低豐度蛋白大部分的蛋白質(zhì)是低豐度的蛋白質(zhì)，而低豐度的蛋白質(zhì)往往是執(zhí)行重要生物功能的蛋白質(zhì)，如調(diào)控蛋白、信號轉(zhuǎn)導蛋白和受體蛋白等。密碼子偏性（codonbias,CBI）:指生物體中編碼同一種氨基酸的同義密碼子的非均衡使用現(xiàn)象。密碼子偏性系數(shù)（codonbiasindex）:CBI小于0.2的基因編碼的蛋白質(zhì)為低豐度蛋白質(zhì)。酵母中2500個編碼基因的CBI小于0.1。48%一步法（one-extract-one-gel）：一步提取的細胞總蛋白在一塊膠上進行電泳分離；適用于高豐度蛋白加大上樣量，但有限制窄范圍的IPG膠條（2-3個pH單位）、非常窄范圍的IPG膠條（約1個pH單位）：可以增加電泳膠的分辨率，加大樣品的負載量，但存在超出pH范圍的蛋白去除高豐度的蛋白質(zhì)2.2膜蛋白膜蛋白是一些疏水性的蛋白質(zhì)，在常規(guī)2-DE的提取液中的溶解度低，另外因聚焦而產(chǎn)生濃縮、聚集，從而使得膜蛋白很難融解并進入二向SDS電泳，因此很難被檢測解決方法:分布提取法。2.3樣品預分離（pre-fractionation)2.3.1分步提取法（sequentialextraction）原理：蛋白質(zhì)的溶解度差異采用3種不同的提取液進行分步提取和分別電泳；除了2-DE的等電點和分子量分離，實際上是增加了溶解性能不同的第三維分離2.3.2多間隔電離法（multi-compartmentelectrolyser）實質(zhì)上是一種制備等電聚焦的方法。電泳裝置由中間的聚焦室和兩端的電極室組成。聚焦室由隔膜分成多個樣品室。電極室內(nèi)裝電極，由陰陽離子交換膜將電解質(zhì)與樣品分開。操作時，將預分離的蛋白質(zhì)混合物放進聚焦室中，隨著等電聚焦電泳的進行，混合物中的蛋白質(zhì)根據(jù)各自的等電點不同而聚焦到相應的樣品室中并被分別收集3.堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測3.1很難被分開：商業(yè)化的IPG膠條的pH范圍通常在3-10，等電點超過10的蛋白質(zhì)很難被分開。目前已經(jīng)有pH范圍到12的IPG膠條，從而得到了部分的解決3.2大部分的細胞提取物是酸性蛋白質(zhì)：去除酸性蛋白質(zhì)改善堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測?？梢圆捎脛偛沤榻B的方法，制備等電聚焦預分離，將堿性蛋白質(zhì)富集，再采用堿性pH梯度膠進行分離解決方法：擴大pH范圍（IPGpH12)4.IPG膠條的改進4.1膠條的pH范圍在不斷變窄：改善了2-DE的分辨率，增加了上樣量，從而提高了蛋白質(zhì)的檢出，而且可以針對不同樣品選擇不同的膠條4.2膠條的pH范圍也在不斷擴大：改善了堿性蛋白質(zhì)的分離4.3不同長度的膠條：通常采用的是18cm的膠條，可以達到2000種以上蛋白質(zhì)點的分辨率；24cm、40cm5.高通量與自動化5.1蛋白質(zhì)組研究的高通量需要研究體系的自動化：集中在2-DE后的樣品處理和蛋白質(zhì)的識別5.2自動點切割儀，自動樣品處理機等：減少了手工操作，縮短了時間，提高了效率；提高了樣品處理的重復性，避免了手工操作易產(chǎn)生的污染5.3可同時運行12塊膠的二向SDS電泳槽已經(jīng)研制成功并商品化蛋白質(zhì)識別系統(tǒng)的自動化2-DE,染色，凝膠分析膠上蛋白質(zhì)自動切割置于96或384孔板

自動蛋白酶解，多肽可回收，點樣于MS樣品靶自動MS樣品分析

自動采集數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索，蛋白鑒定5.4分子掃描（molecularscanner）：

將一個固相化了胰蛋白酶的PVDF膜插入2-DE電泳膠和另一個PVDF膜之間，后一個PVDF膜作為收集膜。當對上述體系進行電轉(zhuǎn)印時，膠上的蛋白質(zhì)在向第一個PVDF膜遷移的過程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿過帶有固相化胰酶的PVDF膜，被第二個PVDF膜收集。收集膜可直接用于MALDI-TOF-MS做肽質(zhì)量指紋譜分析。優(yōu)點：分子掃描實現(xiàn)了2-DE后的樣品處理與質(zhì)譜分析一體化，為整個2-DE/MS技術體系的自動化打下了基礎；缺點：膜上酶切-質(zhì)譜分析獲得的肽段數(shù)目低，使蛋白質(zhì)特別是翻譯后修飾蛋白質(zhì)的識別與鑒定效率受到影響。6.2-DE的局限性實驗設計：樣本間的異質(zhì)性以及組織中多種細胞的并存，將影響實驗結果的可靠性。激光捕獲顯微切割的方法（laser-capturemicrodissection,LCM）：單一細胞重復性：2-DE方法存在的主要問題動態(tài)范圍：有限的動態(tài)范圍與低拷貝蛋白質(zhì)的難以檢測也是2-DE目前尚未完全解決的問題。放射性同位素標記蛋白質(zhì)的丟失：疏水性蛋白質(zhì)、分子質(zhì)量大于100kDa的蛋白質(zhì)通量和自動化：圖像分析仍然是瓶頸二、色譜－質(zhì)譜技術1.二維色譜－串連質(zhì)譜技術（2D-HPLC-MS-MS）1.1二維色譜分離蛋白質(zhì)和多肽優(yōu)點缺點2-DE高分辨率，>1000個蛋白質(zhì)可得到等電點、相當分子質(zhì)量信息可得到蛋白質(zhì)表達譜可平行運行多個膠費時、費力；不易自動化疏水、酸性、堿性、<10kDa、>200kDa蛋白易丟失樣品負載量受限制2D-HPLC快速可分離各種蛋白質(zhì)易于自動化樣品在液相；餾分易收集可做樣品制備或濃縮不能得到等電點、相對分子質(zhì)量信息尚未實現(xiàn)平行操作不易得到蛋白質(zhì)表達譜分辨率不夠高2-DE與2D-HPLC的比較二維色譜分離蛋白質(zhì)的優(yōu)勢：快速；可分離各種蛋白質(zhì)；樣品在液相，餾分易收集；易于自動化；可做樣品制備或濃縮二維色譜分離蛋白質(zhì)有多種組合模式：第一維色譜一般是離子交換色譜/凝膠過濾色譜，第二維通常是反相色譜1.2二維色譜－串連質(zhì)譜分離鑒定細胞蛋白質(zhì)采用二維色譜－串連質(zhì)譜技術可以對混合蛋白質(zhì)物進行直接分離與鑒定。步驟如下：樣本蛋白質(zhì)混合物蛋白酶裂解二維色譜分離質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)優(yōu)勢：識別和鑒定低豐度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、堿性蛋白以及相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)不足：通過蛋白質(zhì)直接酶切得到的肽段混合物過于復雜，較難實現(xiàn)對細胞全部蛋白質(zhì)的識別與鑒定2.同位素標記（ICAT）-親和色譜-質(zhì)譜技術ICAT，isotope-codedaffinitytagging：不但可以實現(xiàn)對細胞差異表達蛋白質(zhì)的定量分析，而且可以大大簡化被分析樣品的復雜性ICAT方法的關鍵是ICAT試劑的應用：半胱氨酸生物素標簽

連接部分（重鏈或輕鏈）巰基特異反應基團ICAT試劑示意圖方法：蛋白質(zhì)進行ICAT試劑標記蛋白酶切親和色譜分離（只有被同位素標記的肽段能被色譜柱保留）進入質(zhì)譜進行鑒定通過比較標記重鏈和輕鏈試劑肽段在質(zhì)譜圖中信號的強度，可以實現(xiàn)對差異表達蛋白質(zhì)的定量分析，采用串連質(zhì)譜技術測定肽段的序列，可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的定性鑒定同位素標記（ICAT）-親和色譜-質(zhì)譜技術當同采用ICAt技術進行蛋白質(zhì)的定量分離與鑒定時，首先是對蛋白質(zhì)進行ICAT試劑標記，然后進行蛋白酶切，對蛋白酶切后的多肽混合物進行親和色譜分離，混合物中僅僅被同位素標記的肽段能夠被色譜柱保留并進入質(zhì)譜進行監(jiān)督，其他大量肽段都不被色譜柱保留。通過比較標記重鏈和輕鏈試劑肽段在質(zhì)譜圖中信號的強度，可以實現(xiàn)對差異表達蛋白質(zhì)的定量分析，采用串連質(zhì)譜技術測定肽段的序列，可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的定性鑒定優(yōu)勢：可以實現(xiàn)對不同條件處理的細胞差異蛋白質(zhì)的定量分析，而且大大簡化了被分離樣品的復雜程度不足：無法分析和鑒定不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)；試劑的高價位三、一維電泳（色譜）－質(zhì)譜技術1.一維SDS電泳（色譜）－質(zhì)譜分離鑒定蛋白質(zhì)復合物蛋白質(zhì)復合物的分離與鑒定是功能蛋白質(zhì)組研究的核心內(nèi)容；SDS電泳結合MALDI-TOF-MS技術，或者蛋白酶切結合LC-MS-MS技術直接分離和鑒定蛋白質(zhì)復合物被證明是一種有效的方法。該方法的基本過程如圖所示。從生物樣本中獲得的蛋白質(zhì)混合物采用免疫沉淀或者免疫親和提取的方法獲得蛋白質(zhì)復合物，SDS電泳對蛋白質(zhì)復合物進行分離、染色、膠上原位酶切，MALDI=TOF-MS分析肽質(zhì)量指紋普并鑒定蛋白質(zhì)或者對蛋白質(zhì)復合物直接進行蛋白酶切，對獲得的肽段混合物進行LC-MS-MS分析，通過測定太片段的序列鑒定蛋白質(zhì)。2.一維IEF電泳－質(zhì)譜分離鑒定蛋白質(zhì)與質(zhì)譜方法相比，SDS測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量誤差大，分辨率差，更重要的是，很難獲得翻譯后修飾蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量變化的準確信息；精確測定全細胞蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量是難題；一維IEF電泳－質(zhì)譜技術：采用IPG膠條進行等電聚焦電泳，MALDI-TOF-MS對膠條進行表面直接分析。將一維IEF電泳與準確、靈敏、高分辨率的相對分子質(zhì)量測定技術相結合，誤差0.1％-0.2％1886年Goldstein發(fā)明早期質(zhì)譜儀的離子源，1942

年第一臺商品化質(zhì)譜儀出現(xiàn)——分析小分子化合物。20世紀80年代末期的兩項軟電離質(zhì)譜技術—電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)——分析蛋白質(zhì)，具有高靈敏度（pmol）和高質(zhì)量檢測范圍（幾萬到幾十萬Da）一、生物質(zhì)譜技術MALDI-TOF-MS:高通量，肽指紋圖譜，須數(shù)據(jù)庫匹配。ESI-MS:肽序列標簽，特異性高，混合肽測定，操作繁瑣。其特點之一是可以和液相色譜、毛細管電泳等高效分離手段聯(lián)用，因而可以實現(xiàn)復雜化合物分離與鑒定的聯(lián)機操作。第三節(jié)高通量蛋白質(zhì)鑒定技術MALDI-TOF：常用飛行時間質(zhì)量分析器，所構成的儀器成為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀；特點是對鹽和填加物的耐受能力強，且操作簡單，測定速度快，易于實現(xiàn)高通量，譜峰與樣品成分的質(zhì)量有一一對應關系，圖譜容易解析離子阱（iontrap）質(zhì)譜儀和傅立葉變換離子回旋共振（fouriertransformioncyclotronresonance,FTICR）質(zhì)譜電噴霧－四極桿－飛行時間質(zhì)譜儀：大大提高了儀器的分辨率和靈敏度帶有串連質(zhì)譜功能的MALDI-TOF質(zhì)譜儀：引進了源后裂解或碰撞誘導解離裝置，可進行肽序列測定二、2-DE膠上蛋白質(zhì)識別與鑒定技術2-DE電泳已知蛋白蛋白質(zhì)膠上原位酶切MALDI-TOF-MS分析肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)鑒定ESI-MS-MS分析蛋白質(zhì)鑒定肽序列標簽數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)從頭測序新蛋白已知蛋白易于實現(xiàn)高通量特異性高，可實現(xiàn)分離、鑒定一體化操作2-DE膠上蛋白質(zhì)鑒定流程圖50－60％20－30％MALDI-TOF-MS：優(yōu)點是易于實現(xiàn)高通量，適合于膠上蛋白質(zhì)的高通量、大規(guī)模識別與鑒定；但不適合分析蛋白質(zhì)混合樣品或新蛋白，且準確度要求較高ESI-MS-MS：優(yōu)點是特異性高，且適合混合樣品的蛋白識別與鑒定；與液相色譜相連可實現(xiàn)分離、鑒定一體化操作；但分析速度慢且操作復雜三、生物質(zhì)譜新技術帶MALDI源的四極桿－飛行時間質(zhì)譜儀(MALDIQqTOF)將MALDI離子源與四極桿－飛行時間－串連質(zhì)譜儀連接，從而實現(xiàn)了樣品靶上的同一個樣品在同一臺質(zhì)譜儀上的肽質(zhì)量指紋譜分析與肽序列標簽分析同時進行。已經(jīng)成功用于2DE膠上蛋白質(zhì)的鑒定。2.

MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀該儀器將MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋譜分析的高通量與碰撞誘導解離（collision-induceddissociation,CID）獲得的豐富碎片信息相結合，對同一樣品相進行肽質(zhì)量指紋譜分析，接著進行串連質(zhì)譜分析，使得在微量樣品水平上對蛋白質(zhì)的鑒定在數(shù)秒內(nèi)完成。目前，二維-聚丙烯酰胺凝膠電泳依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中復雜蛋白混合物的核心技術。而選擇合適的樣品制備方法對獲得滿意的二維電泳圖譜是十分重要的。對不同類型的蛋白進行樣品制備時，需要采用不同的方法和條件。溶解的效果依靠選擇的細胞破碎方法、蛋白解聚和溶解方法、去污劑和裂解液成分等來實現(xiàn)。裂解的目的是盡可能的完全溶解、解離、變性和還原蛋白質(zhì)。

第四章蛋白質(zhì)的提取與分離4.1蛋白質(zhì)的提取二維電泳分析中的樣品制備制備標準：應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白質(zhì)的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾因素。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白質(zhì)，從而保證待研究蛋白質(zhì)的可檢測性。

樣品制