放射毛霉3278羧肽酶水解產(chǎn)物的制備及體外抑菌活性

放射毛霉3278羧肽酶水解產(chǎn)物的制備及體外抑菌活性

羧酶是一種從羧基末端轉(zhuǎn)化得到的水解酶，該酶從末端提取氨基酸。從該活性物質(zhì)中獲得的產(chǎn)物和游離氨基酸的性質(zhì)對(duì)提出的乳化和豆豆菌素的形成非常重要。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)酶解產(chǎn)物的苦味源于產(chǎn)物中羧基末端是疏水性氨基酸的肽,尤其當(dāng)羧基末端是亮氨酸時(shí),肽的苦味就更強(qiáng)。羧肽酶切除苦味肽羧基末端的疏水性氨基酸,引起肽的疏水性降低,苦味隨之減弱。曲霉羧肽酶、小麥羧肽酶及動(dòng)物來源的羧肽酶作用于酪蛋白和大豆蛋白水解產(chǎn)物的研究結(jié)果都證實(shí)了羧肽酶具有脫苦作用。潘進(jìn)權(quán)等通過研究提出毛霉分泌的肽酶水解酶含有較為豐富的氨基肽酶、羧基肽酶或生成小肽的肽酶,而且可能正是這些外肽酶參與了水解肽類形成氨基酸的作用促使腐乳、無苦味大豆多肽等獨(dú)特品質(zhì)和良好風(fēng)味的形成。本課題組研究證實(shí)了毛霉發(fā)酵液也能夠明顯除去大豆蛋白水解產(chǎn)物的苦味,具有很強(qiáng)的脫苦能力,而且對(duì)合成肽N-CBZ-Ile-Leu表現(xiàn)明顯羧肽酶活性。2004年,馬曉航等報(bào)道了從雅致放射毛霉中分離純化出一種氨肽酶。Actinomucorelegans即雅致放射毛霉(屬),屬于毛霉科,被認(rèn)為是豆腐乳生產(chǎn)的最優(yōu)良菌種。本研究通過固態(tài)發(fā)酵雅致放射毛霉菌株Actinomucorelegans3.2778,對(duì)酶液中羧肽酶的性質(zhì)進(jìn)行了較為全面的探索。為毛霉羧肽酶的分離純化以及脫苦酶制劑的研究和開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)依據(jù)。1材料和方法1.1材料和機(jī)器1.1.1細(xì)菌和培養(yǎng)基雅致放射毛霉Actinomucorelegans3.2778:北京王致和腐乳廠提供。斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。1.1.2聚op、苯甲基磺酰氟-二硫蘇糖酯、碘乙酸、二硫蘇糖酸3-5,10-四氫-1,10-四氫-1,10-四氫-3,10-種甲基苯磺酸鹽mttN-芐氧羰酰基-L-苯丙胺酰-L-亮氨酸(N-CBZ-Phe-Leu)、茚三酮、1,10-鄰菲啰啉(OP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酸:Sigma公司;二異丙基磷酰氟(DFP)、對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)Merck公司;DTT(二硫蘇糖醇)、L-亮氨酸:北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.3u3000材料LRH-150-MS霉菌培養(yǎng)箱:韶關(guān)市明天環(huán)保儀器有限公司;YX-280D不銹鋼手提式高壓滅菌鍋:合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;CR-22G型高速冷凍離心機(jī):日本HITACHI;UV2300紫外-可見分光光度計(jì):上海天美科學(xué)儀器有限公司;SevenEasypH計(jì):瑞士MettlerToledo;H.S.GIO-2電熱恒溫水浴鍋:浙江臨海市東方儀器廠。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基將4℃保存的斜面菌種轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3d,制作孢子懸浮液。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基由麩皮和蒸餾水按1∶1組成。接種1mL孢子懸浮液于已滅菌培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中,28℃培養(yǎng)48h。1.2.2水、阿利克氏培養(yǎng)結(jié)束后,每個(gè)錐形瓶中加入100mL無菌去離子水,于4℃過夜。提取液用4層紗布過濾,離心(4℃、4020×g、10min)后得到的上清液即為粗酶液,4℃透析粗酶液24h,測(cè)定時(shí)經(jīng)緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。1.3羧酶活性測(cè)定1.3.1酶反應(yīng)定量移取1.8mL底物(Z-Phe-Leu,2.0mmol/L)溶液于5mL離心管中,再加入酶液0.2mL,37℃保溫6h。1.3.2亮氨酸樣品的制備亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:精確配制2.0mmol/L的L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取16支試管,分為2個(gè)平行組,用蒸餾水稀釋得一系列濃度0mmol/L~150.0mmol/L的亮氨酸溶液1.0mL,加入2.0mL鎘-茚三酮試劑,84℃水浴加熱5min,冷卻至室溫,測(cè)定波長(zhǎng)507nm處的吸光度值。從酶底物反應(yīng)液中量取50μL,再加入950μL蒸餾水,得到1.0mL的稀釋后樣品,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定。產(chǎn)物濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。酶活定義為在pH7.0、溫度37℃條件下,每小時(shí)每毫升粗酶液使底物分解產(chǎn)生的亮氨酸的微摩爾數(shù),μmol/(mL·h)。2結(jié)果與討論2.1土壤有機(jī)溶劑最佳ph值及酶活力配制一系列pH值為3.5~11.0的緩沖液,以0.5單位為梯度,pH3.5~6.0(Na2HPO4-檸檬酸),pH6.5~7.5(K2HPO4-KH2PO4),pH8.0~9.0(Tris-HCl),pH9.5~10.0(Na2B4O7-NaOH),pH10.5~11.0(NaHCO3-NaOH)。緩沖液適當(dāng)稀釋酶液,并制備相應(yīng)pH值的底物溶液。以最高的酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活,結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,酶液在pH5.0~9.5都具有羧肽酶活力,而且酸性、中性和堿性范圍內(nèi)都有酶活峰出現(xiàn),最大酶活峰出現(xiàn)在5.5<pH值<7.5,說明放射毛霉羧肽酶是以中性偏酸性羧肽酶為主的復(fù)合酶系。羧肽酶最適pH值為6.0~7.2,羧肽酶的最適pH值為6.6。表明放射毛霉羧肽酶作用的pH值范圍較寬。而且,測(cè)定酶活應(yīng)在近中性環(huán)境,因?yàn)閺?qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境都不利于放射毛霉發(fā)揮羧肽酶的外切作用。2.2ph值對(duì)羧肽酶穩(wěn)定性的影響用不同pH值緩沖液分別將酶液稀釋5倍,4℃放置24h后進(jìn)行酶活測(cè)定,以T=0時(shí)的酶活為100%計(jì)算殘留酶活,結(jié)果見圖2。圖2結(jié)果表明,在pH值為3.5~6.5時(shí),羧肽酶的穩(wěn)定性隨著pH值的改變波動(dòng)較大,pH值>6.5時(shí),穩(wěn)定性緩慢增強(qiáng)。除pH值為5.0和pH值為6.5時(shí),羧肽酶在pH3.5~11.0緩沖液中4℃放置24h,殘留酶活都在70%以上。因此,除pH值為5.0和pH值為6.5時(shí),放射毛霉羧肽酶在整個(gè)pH值范圍內(nèi)都具有良好的穩(wěn)定性。2.3酶的測(cè)定結(jié)果將透析后酶液用20.0mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)稀釋5倍,底物Z-Phe-Leu用相同緩沖液溶解至終濃度為2.0mmol/L,酶和底物在不同的溫度(30℃~70℃,以5℃為梯度)進(jìn)行酶活測(cè)定,結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果表明,放射毛霉羧肽酶的最適作用溫度為40℃,當(dāng)溫度在30℃~40℃之間時(shí),羧肽酶活力隨著溫度升高而逐漸增強(qiáng);在較寬的溫度范圍內(nèi)(40℃~45℃)都能保持較高活力。當(dāng)溫度高于45℃,羧肽酶活力隨著溫度升高迅速減弱。2.4保溫時(shí)間對(duì)羧肽酶相對(duì)酶活的影響將稀釋后的酶液在不同溫度水浴加熱3h,每30min取樣1次,樣品迅速放置在冰水浴中降溫,然后恢復(fù)至室溫并進(jìn)行酶活測(cè)定,結(jié)果見圖4。圖4結(jié)果表明,酶液在30℃、35℃、40℃保溫3h后,殘留的羧肽酶相對(duì)酶活均在70%以上,說明放射毛霉羧肽酶在30℃~40℃時(shí)具有良好的穩(wěn)定性;在45℃條件下,隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng),酶液殘留酶活迅速下降;當(dāng)溫度≥50℃、保溫30min時(shí),殘留的羧肽酶相對(duì)酶活隨著溫度的升高迅速下降。這說明加熱溫度對(duì)羧肽酶的影響遠(yuǎn)大于加熱時(shí)間的影響。同時(shí)說明放射毛霉羧肽酶不是一種耐高溫酶類。2.5殘留酶活與酶活比的關(guān)系將含有Zn2+、Mn2+、Ca2+、Hg2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ba2+、Ni+、Li+、K+、Na+、NH4+的鹽溶液加入酶液中,37℃保溫1h后進(jìn)行酶活測(cè)定(金屬離子在溶液中的濃度為0.99mmol/L和9.1mmol/L)。以相同條件下不含金屬離子樣品的酶活為100%計(jì)算殘留酶活。圖5結(jié)果表明,Mg2+、和NH4+都能促進(jìn)羧肽酶活力,其中鹵化物形式的Mg2+(0.99mmol/L)促進(jìn)作用最顯著,相對(duì)酶活達(dá)137%,硫酸鹽形式Mg2+促進(jìn)作用次之;Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ni+、Hg2+對(duì)羧肽酶活力表現(xiàn)出強(qiáng)烈抑制作用,殘留酶活約10%;Zn2+、Ca2+、Mn2+、Co2+對(duì)羧肽酶有一定程度的抑制作用;而Ba2+、Li+、K+和Na+對(duì)羧肽酶影響不明顯。2.6金屬離子對(duì)羧肽酶的活性影響向酶液中分別加入乙二胺四乙酸(EDTA)、1,10-鄰菲啰啉(OP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二異丙基磷酰氟(DFP)、二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)、碘乙酸至終濃度分別為0.99mmol/L和9.1mmol/L,37℃保溫1h后進(jìn)行酶活測(cè)定,以相同條件處理且不含金屬離子的酶液酶活為100%計(jì)算殘留酶活。結(jié)果見附表?；瘜W(xué)修飾實(shí)驗(yàn)結(jié)果(附表)表明,金屬蛋白酶的抑制劑中,弱抑制劑EDTA對(duì)羧肽酶酶活抑制作用較弱,而強(qiáng)抑制劑1,10-鄰菲啰啉在低濃度水平(0.99mmol/L)即可抑制70%的酶活;絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、DFP對(duì)羧肽酶有強(qiáng)抑制作用;巰基抑制劑PCMB、DTT、碘乙酸和β-巰基乙醇對(duì)羧肽酶活性也有一定的抑制作用。表明羧肽酶活性中心含有絲氨酸殘基和二硫鍵結(jié)構(gòu),能被金屬離子Mg2+激活。這一結(jié)果類似于嗜熱芽孢桿菌高溫蛋白酶HS08的活性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。3最適條件探討2羧肽酶活力3.1麩皮培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵雅致放射毛霉菌株Actinomucorelegans3.2778得到羧肽酶粗酶液,對(duì)底物肽N-CBZ-Phe-Leu具有羧肽酶活性。3.2羧肽酶最適作用pH值為6.0~7.2,最適作用pH值為6.6;最適作用溫度為40℃~