魚精蛋白凝聚法測(cè)定脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體包封率

魚精蛋白凝聚法測(cè)定脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體包封率

封閉率是衡量脂質(zhì)體內(nèi)部質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。這意味著將含有糊狀物的藥物參與脂質(zhì)體懸浮液中的藥物總量。測(cè)定包封率的關(guān)鍵是把未包封的游離藥物從脂質(zhì)體混懸液中分離出來(lái),常用的分離方法有葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法、超速離心法、超濾膜過(guò)濾法等。葡聚糖凝膠柱色譜是較為常用的方法,但是此法不適用于脂溶性藥物,因?yàn)橛坞x的脂溶性藥物不能被水性介質(zhì)從葡聚糖凝膠柱上洗脫下來(lái)。另外,由于葡聚糖表面上許多位點(diǎn)能與脂質(zhì)體膜結(jié)合并相互作用,引起部分脂質(zhì)丟失,導(dǎo)致膜滲透性的改變及包裹物質(zhì)的滲漏且脂質(zhì)體易被稀釋。透析法不需要復(fù)雜的技術(shù),適合分離小分子物質(zhì),但其過(guò)程緩慢,比較耗時(shí),且造成脂質(zhì)體混懸液稀釋;超速離心法易破壞脂質(zhì)體,且對(duì)于小粒徑脂質(zhì)體特別是納米脂質(zhì)體分離效果較差。超濾膜過(guò)濾法是利用超濾膜不同孔徑對(duì)液體進(jìn)行分離的物理篩分,但仍存在回收率低于90%的問(wèn)題。由于以上常用方法的測(cè)定機(jī)制是基于分子大小或密度差異進(jìn)行的,故而較難將脂質(zhì)體與藥物晶體和(或)脂質(zhì)體碎片分離,影響包封率測(cè)定。因此,有必要建立一種新的針對(duì)脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體的包封率測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)利用魚精蛋白凝聚法分離脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體,以高效液相色譜法為分析手段,測(cè)定脂質(zhì)體藥物包封率,并與葡聚糖凝膠柱色譜法比較,旨在建立一種簡(jiǎn)單、速效、準(zhǔn)確的脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法。1儀器和試劑盒1.1高效液相色譜法旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52-98(上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);CX-250超聲波清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠);LC-10ATVP-ODS高效液相色譜儀(日本島津);SPD-10AVP紫外檢測(cè)器(日本島津);80-2型離心沉淀機(jī)(國(guó)華儀器有限公司);高壓勻質(zhì)機(jī)(意大利Niro-Soaro型號(hào)NS1001L);ZETASIZER3000粒度分布與電勢(shì)分析儀(Zetasizer3500HS,英國(guó)Malvern公司);ER-182A型電子天平(日本);JY-92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所);UNICOTMUV-2102PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。1.2試劑與標(biāo)準(zhǔn)試劑托氟啶(TFu),奧沙西羅(Oxaceprol)(山東大學(xué)藥物化學(xué)研究所);碘海醇(Lohexol)(浙江司太立制藥有限公司,批號(hào)031013);胰島素(江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào)0510A02);魚精蛋白(Sigma公司P4380);卵磷脂(上海太偉藥業(yè));膽固醇(上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠,批號(hào)950517);無(wú)水乙醚(天津市廣成試劑有限公司,批號(hào)20011222);SephadexG-50(Sigma公司上海試劑廠分裝);甲醇,乙腈為色譜純;氫氧化鈉、磷酸二氫鉀等均為市售分析純?cè)噭?方法和結(jié)果2.1表內(nèi)藥物封閉率的測(cè)定2.1.1游離藥物的加樣回收率配制低(80%)、中(100%)、高(120%)濃度碘海醇水溶液,分別加入空白脂質(zhì)體(粒徑420和220nm),得均勻脂質(zhì)體混懸液。凝膠SephadexG-50色譜柱色譜法:取0.5mL脂質(zhì)體混懸液上柱,柱色譜條件:凝膠柱SephedexG-50(30cm×1.5cm),用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)洗脫。流速0.5mL·min-1,每2mL收集1管,收集游離藥物組分后,稀釋,定容,HPLC測(cè)定,計(jì)算藥物的加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。魚精蛋白凝聚法:各取上述脂質(zhì)體混懸液0.1mL,添加0.1mL魚精蛋白(10g·L-1)攪勻。靜置3min,加入5.0mL生理鹽水,3000r·min-1離心30min,吸取上清液0.1mL于2.0mL生理鹽水中,HPLC測(cè)定,計(jì)算藥物的加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。兩種方法的藥物加樣回收率基本一致,且結(jié)果都較好。對(duì)于粒徑在220～420nm的水溶性藥物脂質(zhì)體,兩種方法都可將游離藥物與脂質(zhì)體分離。2.1.2碘海醇脂質(zhì)體的分離逆相蒸發(fā)法制備碘海醇脂質(zhì)體,制得脂質(zhì)體粒徑分別為420和220nm,采用葡聚糖凝膠G-50柱色譜法分離碘海醇脂質(zhì)體,分離效果良好。精密吸取0.1mL碘海醇脂質(zhì)體,加5.0mL甲醇破乳,作為總藥量(Wtotal),HPLC法測(cè)定游離藥物(Wfree)和總藥量,按公式EE%=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%計(jì)算包封率,藥物平均包封率分別為84.5%和81.2%。2.1.3游離藥物包封率分別吸取0.1mL碘海醇脂質(zhì)體,添加0.1mL魚精蛋白溶液(10g·L-1)攪勻。靜置3min,加入5.0mL生理鹽水,3000r·min-1離心30min。上清液為游離藥物,HPLC測(cè)定游離藥物和總藥量,按照包封率公式計(jì)算得藥物平均包封率為85.0%和82.0%。對(duì)于水溶性藥物碘海醇,當(dāng)脂質(zhì)體粒徑≥220nm時(shí),應(yīng)用魚精蛋白凝聚法和葡聚糖凝膠G-50柱色譜法分離脂質(zhì)體,藥物回收率均較好,且包封率測(cè)定結(jié)果相當(dāng),表明魚精蛋白凝聚法測(cè)定水溶性藥物脂質(zhì)體包封率可行。2.2脂肪醇固封率的測(cè)定2.2.1tfu脂質(zhì)體分離薄膜分散-乳勻法制得脂質(zhì)體,精密吸取0.5mLTFu脂質(zhì)體(粒徑300nm),葡聚糖凝膠G-50柱色譜法分離脂質(zhì)體,結(jié)果游離藥物出柱較晚,TFu脂質(zhì)體(粒徑300nm)與游離藥物不能很好分離。2.2.2方法回收率①魚精蛋白凝聚法:配制低、中、高濃度TFu乙醚溶液,50℃～60℃N2吹干,添加0.1mL魚精蛋白(10g·L-1),靜置3min,加入5.0mL生理鹽水,3000r·min-1離心30min,吸取上清液0.1mL于2.0mL生理鹽水中,HPLC測(cè)定,計(jì)算藥物的方法回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。②凝膠SephadexG-50色譜柱色譜法:配制低、中、高3濃度的TFu溶液(50%的乙腈溶液),葡聚糖凝膠G-50柱色譜法分離,洗脫時(shí)發(fā)現(xiàn)藥物在柱中結(jié)晶析出;改用藥物與輔料混合的乙醇溶液上樣0.1mL,收集游離藥物組分后HPLC測(cè)定,計(jì)算TFu柱回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。應(yīng)用葡聚糖凝膠G-50柱色譜法,TFu回收率較低,魚精蛋白凝聚法藥物回收率良好。2.2.3加樣回收率測(cè)定配制低、中、高濃度的TFu乙醚溶液,50℃～60℃N2吹干,分別加入空白脂質(zhì)體(粒徑300nm),分別測(cè)定魚精蛋白凝聚法與凝膠SephadexG-50色譜柱色譜法的加樣回收率,結(jié)果分別為(101±1.14)%,(100±1.19)%和(102±1.85)%以及(68±1.18)%,(71±0.70)%和(76±1.22)%。葡聚糖凝膠柱色譜法分離TFu脂質(zhì)體回收率較低,重現(xiàn)性也差;用魚精蛋白凝聚法可較準(zhǔn)確測(cè)定。2.3采用魚精、蛋白融合法分離不同粒徑的脂質(zhì)體材料法進(jìn)行研究2.3.1魚精蛋白用量對(duì)tfu脂質(zhì)體方法回收率的影響薄膜分散-乳勻法制得不同粒徑的空白脂質(zhì)體(500,300,235,175,100nm);計(jì)算魚精蛋白凝聚法加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。TFu脂質(zhì)體粒徑≥300nm時(shí),加入等量的魚精蛋白對(duì)回收率沒(méi)有影響;但TFu脂質(zhì)體粒徑≤235nm時(shí),隨著脂質(zhì)體粒徑減小,加同樣量魚精蛋白,回收率下降。魚精蛋白(10g·L-1)用量由0.1mL分別增加為0.2,0.3,0.5mL,測(cè)得粒徑235nm以下脂質(zhì)體的方法回收率結(jié)果見(jiàn)表4。增加魚精蛋白用量后回收率提高,脂質(zhì)體粒徑減少所需魚精蛋白量增加。2.3.2魚精蛋白凝聚法分離逆相蒸發(fā)法制備小粒徑碘海醇脂質(zhì)體(180和115nm),采用葡聚糖凝膠G-50柱色譜法和魚精蛋白凝聚法進(jìn)行分離,分別測(cè)得加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表5。當(dāng)?shù)夂４贾|(zhì)體粒徑減少至115nm時(shí),葡聚糖凝膠G-50柱色譜法不能準(zhǔn)確測(cè)定納米脂質(zhì)體(≤180nm)包封率,而魚精蛋白凝聚法可準(zhǔn)確測(cè)定。2.4魚精蛋白凝聚法方法回收率調(diào)節(jié)TFu脂質(zhì)體(粒徑為235nm)混懸液pH值為1.12,7.55和12.0,使TFu脂質(zhì)體Zeta電位分別為-44.07,-4.76和14.5mV。測(cè)定魚精蛋白凝聚法方法回收率,結(jié)果(%)分別為98.1±0.79,95.3±1.24和86.6±1.39。脂質(zhì)體Zeta電位影響藥物回收率,Zeta電位為負(fù)值時(shí),回收率較高,Zeta電位為正值時(shí),回收率降低,這可能與魚精蛋白帶正電荷有關(guān),所以魚精蛋白凝聚法更適用于中性或Zeta電位為負(fù)值脂質(zhì)體的分離。2.5u3000添加naoh溶液配制200mg·L-1奧沙西羅(Oxaceprol)標(biāo)準(zhǔn)品水溶液,用0.4%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0使藥物荷負(fù)電。吸取胰島素PBS緩沖液(pH7.0)濃儲(chǔ)液(1g·L-1),分別加入0.01mol·L-1HCl和0.4%的NaOH溶液,調(diào)節(jié)pH為2.0(荷正電)和7.0(荷負(fù)電),用PBS緩沖液(pH7.0)稀釋,配制濃度為100mg·L-1的溶液。分別測(cè)定魚精蛋白凝聚法方法回收率和加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表6。奧沙西羅為小分子弱酸性藥物,加堿解離使其帶負(fù)電荷;胰島素為大分子蛋白質(zhì),胰島素等電點(diǎn)為5,在pH2.0和pH7.0的條件下分別帶正電和負(fù)電,在加入魚精蛋白后,奧沙西羅和帶正電的胰島素的回收率都較好,而帶負(fù)電的胰島素的回收率則較低。3魚精蛋白凝聚法的應(yīng)用3.1為準(zhǔn)確測(cè)定包封率,將納米粒或脂質(zhì)體和游離藥物分離是關(guān)鍵的步驟,常規(guī)的分離方法是基于分子大小或密度差異進(jìn)行的,但有時(shí)較難將脂質(zhì)體與藥物晶體和(或)脂質(zhì)體碎片分離;而最常用的葡聚糖凝膠柱色譜法的應(yīng)用也具有一定局限性,它不適用于脂溶性藥物的分離,因?yàn)橛坞x的脂溶性藥物不能被水性介質(zhì)從葡聚糖凝膠柱上洗脫下來(lái),造成游離藥物回收困難,回收率較低。3.2魚精蛋白的最大特點(diǎn)就是堿性氨基酸占有較大比例,其等電點(diǎn)為10～12,可溶于水和稀酸,熱穩(wěn)定性較好。本實(shí)驗(yàn)所用魚精蛋白是Sigma生產(chǎn)的鮭魚精蛋白(salmine),約含2/3以上的精氨酸。精氨酸是一種含有胍基的堿性氨基酸,帶正電,正是由于這些帶有正電荷的胍基的大量存在,多聚陽(yáng)離子魚精蛋白會(huì)與帶負(fù)電或中性的脂質(zhì)體產(chǎn)生絮凝作用,常規(guī)離心即可將脂質(zhì)體和游離藥物分離,因此它是一種針對(duì)脂質(zhì)體或納米粒電荷性質(zhì)的凝聚離心法,具有快速,可操作性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。3.3采用葡聚糖凝膠G-50柱色譜法分離納米脂質(zhì)體時(shí),由于其粒徑小,出柱晚,與游離藥物不能很好分離,葡聚糖凝膠G-50柱色譜法不能準(zhǔn)確測(cè)定納米脂質(zhì)體(≤180nm)包封率,而魚精蛋白凝聚法可準(zhǔn)確測(cè)定。脂質(zhì)體粒徑減少所需魚精蛋白量增加,這可能與脂質(zhì)體粒徑減少,表面積增加,吸附魚精蛋白量增加有關(guān)。對(duì)于不同粒徑的脂質(zhì)體,通過(guò)調(diào)節(jié)魚精蛋白用量可較準(zhǔn)確的測(cè)定脂溶性藥物脂質(zhì)體的包封率。盡管魚精蛋白帶正電荷,但負(fù)電荷小分子藥物不會(huì)與其結(jié)合,帶正電荷的胰島素大分子也沒(méi)有與魚精蛋白結(jié)合,而帶負(fù)