2005國際clsiccls-m100藥敏試驗標準指南解讀

2005國際clsiccls-m100藥敏試驗標準指南解讀

在大多數(shù)國家，美國臨床實驗室（cnis）推薦的藥物過敏試驗方法和評估基準。2005年該委員會更名為臨床試驗標準研究所(CLSI),考慮到大多數(shù)國家地區(qū)的習慣,在過渡時期暫時稱為CLSI/NCCLS,其相應(yīng)的標準改稱為CLSI文件。CLSI/NCCLS-M100藥敏測定指南為適應(yīng)臨床實際工作的需要,每年都會依實際情況加以更新和修訂。2005版CLSI/NCCLSM100-S15的主要增補內(nèi)容包括藥敏試驗培養(yǎng)溫度、達托霉素藥敏試驗和報告、藥敏試驗質(zhì)量保證菌株的使用、β-溶血鏈球菌克林霉素誘導耐藥的檢測、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰氨酶菌株(ESBL)篩選試驗及確證試驗在奇異變形桿菌中的應(yīng)用、腦膜炎奈瑟球菌的藥敏試驗等內(nèi)容。本文就相關(guān)內(nèi)容予以介紹,以使國內(nèi)業(yè)界同行們對此有一定的了解。一、假陽性鑒定難1.葡萄球菌屬33~35℃,不要超過35℃。其原因是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和MRCNS的鑒定在超過35℃時存在假陽性問題。2.其他細菌的藥敏試驗培養(yǎng)溫度在35℃±2℃。二、達托激素的作用機制達托霉素是由美國禮來公司最初研究,Cubist制藥公司開發(fā)的一環(huán)脂肽類抗生素。2003年底,美國食品與藥品管理局經(jīng)過快速審理程序批準注射用達托霉素用于治療由一些革蘭氏陽性敏感菌引起的并發(fā)性皮膚感染及皮膚感染。達托霉素的作用機制與其他抗生素不同,它通過擾亂細胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運,從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的生物合成。此外,它還能通過破壞細菌的細胞膜,使其內(nèi)容物外泄而達到殺菌的目的。達托霉素對葡萄球菌和腸球菌的判定標準見表1。達托霉素僅限于對葡萄球菌、腸球菌和β溶血鏈球菌的藥敏試驗,當出現(xiàn)非敏感結(jié)果時,應(yīng)重新鑒定菌種和重復藥敏試驗。值得注意的是紙片擴散法很難發(fā)現(xiàn)對達托霉素敏感性降低的葡萄球菌最低抑菌濃度(MIC>1μg/ml)和腸球菌(MIC>4μg/ml),臨床治療的失敗可能由于紙片擴散法判定為“S”菌株,而實際上對達托霉素敏感性降低。三、質(zhì)控和質(zhì)量保證試驗紙片擴散法中,最常用的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC25923和銅綠假單胞菌ATCC27853。測定MIC最常用的菌株為大腸埃希菌ATCC25922,金黃色葡萄球菌ATCC29213和銅綠假單胞菌ATCC27853。在檢測產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株時,必須增加肺炎克雷伯菌ATCC700603作為質(zhì)控菌株。每日或每周進行質(zhì)控試驗可以保證得到準確的結(jié)果。當質(zhì)控結(jié)果可以接受時說明藥敏試驗所使用設(shè)備、試劑、培養(yǎng)基及耗材和試驗過程是符合要求的。如在“D”試驗使用金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株。使用ATCC菌種進行質(zhì)量保證,其目的是訓練操作人員如何準確地進行藥敏試驗并得到可靠的結(jié)果,保證每個操作者具有正確進行藥敏試驗的能力。同時,還可用以評價結(jié)果的準確性。如2005版CLSI/NCCLS在“D”試驗中增加QA菌株金黃色葡萄球菌ATCCBAA-976(msrA)和金黃色葡萄球菌ATCCBAA-977(ermA),分別作為“D”試驗陰性和陽性結(jié)果的對照。對產(chǎn)ESBL篩選和確證試驗時也應(yīng)加強質(zhì)控和質(zhì)保菌株的試驗(表2)。由于肺炎克雷伯菌ATCC700603的ESBL基因存在于質(zhì)粒上,因此應(yīng)保存該菌在-60℃或者更低的環(huán)境下。四、產(chǎn)esbl的異變形桿菌的篩選奇異變形桿菌-ESBL試驗:奇異變形桿菌產(chǎn)ESBL菌株在美國罕見,有報道在171株奇異變形桿菌中僅1株為產(chǎn)ESBL株。因此,2005版CLSI/NCCLS并不推薦對奇異變形桿菌進行常規(guī)ESBL篩選試驗。但在某些地區(qū)如歐洲、南美等地,產(chǎn)ESBL的奇異變形桿菌分離率較高,常引起醫(yī)院感染的暴發(fā)。當從患者無菌部位分離到奇異變形桿菌,特別是當奇異變形桿菌所引起的菌血癥時,有必要與臨床醫(yī)生商議進行ESBL試驗。2005版CLSI/NCCLS所規(guī)定的奇異變形桿菌的ESBL篩選試驗與大腸埃希菌、產(chǎn)酸和肺炎克雷伯菌篩選試驗有所不同,其中頭孢泊肟的MIC值為≥2μg/ml。確證試驗的判定標準與大腸埃希菌、產(chǎn)酸和肺炎克雷伯菌的相同。奇異變形桿菌ESBLS篩選試驗的判定標準見表3。五、抗感染藥物的敏感試驗2005版CLSI/NCCLSM7(MIC)表建議對不動桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜麥芽窄食單胞菌(不包括銅綠假單胞菌)可常規(guī)進行以下藥物的敏感性試驗,包括替卡西林/克拉維酸、復方磺胺甲噁唑、頭孢噻肟或頭孢曲松、氯霉素、頭孢唑肟和四環(huán)素。而頭孢唑肟和四環(huán)素僅限于尿道分離株的MIC試驗。近年來,多重耐藥的鮑曼不動桿菌使臨床抗感染治療面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。對于慶大霉素、阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、復方磺胺甲噁唑均表現(xiàn)為耐藥的鮑曼不動桿菌,需要加強臨床醫(yī)生與臨床微生物人員的溝通、會診;咨詢國家參考實驗室的臨床微生物學專家;加做其他藥物的敏感試驗,如多粘菌素-E和多粘菌素-B。多粘菌素-E和多粘菌素-B的質(zhì)控范圍見表4。值得注意的是:(1)多粘菌素B的折點可用以推斷多粘菌素E的結(jié)果,≤2μg/ml為“S”、≥4μg/ml為“R”;(2)可向臨床醫(yī)生報告多粘菌素B的結(jié)果,并附可作為多粘菌素E的參考依據(jù)的意見;(3)多粘菌素紙片擴散法不能鑒定某些耐藥株(主要是嗜麥芽窄食單胞菌和不動桿菌);(4)銅綠假單胞菌對多粘菌素的耐藥株罕見。六、meca基因和pbpba檢測1.mecA基因介導耐藥2004年NCCLS曾建議用30μg頭孢西丁紙片代替1μg苯唑西林紙片檢測甲氧西林耐藥的葡萄球菌(MRS),其意義在于mecA基因在高濃度頭孢西丁存在的條件下比苯唑西林更易表達。檢測mecA基因和青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)是確證耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)最準確的方法。雖然非mecA基因介導耐藥的機制罕見,但確實存在。因此,在紙片擴散法確定為耐藥,加做苯唑西林MIC,當≥4μg/ml時,即使mecA基因和PBP2a檢測為陰性,也要報苯唑西林耐藥。對于表皮葡萄球菌頭孢西丁和苯唑西林的紙片擴散法和苯唑西林MIC的判定標準是合適的,但對于其他凝固酶陰性葡萄球菌,如腐生葡萄球菌、路鄧葡萄球菌(slugdunensis)等菌種,該判定標準常造成耐藥率過高。因此,2005版CLSI/NCCLS對路鄧葡萄球菌苯唑西林的判定標準是使用金黃色葡萄球菌的標準(表5)。金黃色葡萄球菌mecA基因介導耐藥的檢測方法,依次為mecA、PBP2a、頭孢西丁紙片法、苯唑西林紙片法或苯唑西林MIC。臨床微生物室常規(guī)試驗結(jié)果可確定為,頭孢西丁紙片法=苯唑西林紙片法=苯唑西林MIC結(jié)果。凝固酶陰性葡萄球菌mecA基因介導耐藥的最好方法為mecA和PBP2a檢測,常規(guī)試驗中頭孢西丁紙片法優(yōu)于苯唑西林紙片法和MIC法(表6)。如果苯唑西林MIC判定為耐藥菌株加做頭孢西丁紙片法可消除假陽性,提高特異性。對于苯唑西林紙片檢測中介的金黃色葡萄球菌必須進行mecA基因檢測、PBP2a檢測、頭孢西丁紙片法、苯唑西林高鹽瓊脂篩選試驗或苯唑西林MIC測定,來確定是否為MRSA菌株。2.萬古霉素中介和萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(VISA/VRSA)的檢測近年來VISA/VRSA已引起有關(guān)人員的普遍關(guān)注,2005版CLSI/NCCLS推薦的方法見表7。3.葡萄球菌對某些氟喹諾酮藥物的判定標準的改變分別調(diào)整了葡萄球菌對氧氟沙星、加替沙星和左氧氟沙星紙片擴散法和MIC的判定標準,同時增加了莫西沙星的MIC標準,(表8、9)。七、克林激素和麻黃的藥敏試驗2004版NCCLS推薦了葡萄球菌屬大環(huán)內(nèi)酯類耐藥機制的鑒別方法,2005版CLSI/NCCLS又將這一檢測方法應(yīng)用于β-溶血鏈球菌(包括A、B、C、Gβ-溶血鏈球菌)。β-溶血鏈球菌的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥機制主要為mef基因編碼的泵出機制、核糖體結(jié)構(gòu)型變異、核糖體可誘導變異三類。后兩類均為erm基因編碼,可使23SrRNA甲基化,第三類又稱為MLSb耐藥(M=大環(huán)內(nèi)酯類,L=林可霉素,Sb=鏈陽霉素B型)?！癉”試驗又名克林霉素誘導試驗,在進行常規(guī)藥敏試驗時,將紅霉素紙片(15μg/片)和克林霉素紙片(2μg/片)貼在鄰近的位置,間距(邊沿到邊沿)12mm、35℃±2℃培養(yǎng)20~24h。如靠近紅霉素紙片處克林霉素的抑菌環(huán)減小,呈英文大寫的D型,則判定為“D”試驗陽性。為保證試驗結(jié)果的可靠性,“D”試驗應(yīng)同時進行QC菌金黃色葡萄球菌ATCC25923和QA菌金黃色葡萄球菌ATCCBAA-976(msrA)和ATCCBAA-977(ermA)的藥敏試驗。B群鏈球菌是引起婦女妊娠期和圍產(chǎn)期感染的重要病原菌,對于分娩期和圍產(chǎn)期婦女預(yù)防性用藥,推薦使用青霉素和氨芐西林。但對青霉素過敏的高危者,建議使用克林霉素或者紅霉素。因此,當從對青霉素過敏的妊娠婦女分離到B群鏈球菌時,應(yīng)進行克林霉素和紅霉素的“D”試驗?？肆置顾爻收T導耐藥的菌株感染者,其中部分使用克林霉素治療是有效的,但臨床醫(yī)生應(yīng)予以注意。八、量資金與質(zhì)控菌株2004年底和2005年初,由腦膜炎奈瑟球菌所致的腦膜炎的暴發(fā)流行引起了社會普遍的關(guān)注。2005版CLSI/NCCLS增補腦膜炎奈瑟球菌的藥敏試驗對于控制和預(yù)防細菌性腦膜炎具有重要意義。腦膜炎奈瑟球菌的MIC微量肉湯稀釋法的操作程序是從巧克力平板(20~24h生長物)制備菌懸液,使用含2%~5%裂解馬血的調(diào)節(jié)過陽離子的MH肉湯,在5%CO2環(huán)境,35℃培養(yǎng)20~24h觀察結(jié)果。質(zhì)控菌株為肺炎鏈