抗菌肽的抗菌機制及細菌耐藥機制

抗菌肽的抗菌機制及細菌耐藥機制

抗菌酶是一種由主枝產(chǎn)生的能夠抵抗外部病原體感染的小分子醚。它廣泛存在于各種生物體中，不僅具有特定的抗凝劑效果，而且還具有腫瘤細胞作用。它與傳統(tǒng)抗生素的作用機制不同,故細菌不易對它產(chǎn)生耐藥性。目前世界上已知的抗菌肽共有1700余種,并且不斷有新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽被補充到抗菌肽數(shù)據(jù)庫中。1抗菌酶的來源1.1抗菌肽的分離和利用自發(fā)現(xiàn)天蠶素以來,至今已從自然生物中成功分離得到上千種抗菌肽,并且分布極其廣泛,目前在微生物、植物和動物中均有發(fā)現(xiàn)并分離得到具有抗微生物活性的多肽。1.1.1抗菌肽的抗菌性能微生物源抗菌肽包括病毒源和細菌源,最早發(fā)現(xiàn)的病毒源抗菌肽是人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)包膜蛋白胞質(zhì)尾部,與其他慢性病毒的穿膜蛋白的抗菌肽一樣,同樣具備抗菌活性和細胞毒性。這類抗菌肽的精氨酸含量高,不含有賴氨酸?？咕木邆淇咕钚?但細菌同樣也能產(chǎn)生抗菌肽保護自身。細菌中已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有bacitracin、polymyxinE、gramicidinS和nisin等4種類型,革蘭陰性菌或陽性菌均可分泌。雖然細菌的種屬繁多,但產(chǎn)生的抗菌肽卻擁有共同點,均為中性肽和陽離子肽。1.1.2“trans”的藥物組成迄今已有8個家族抗菌肽在植物中被發(fā)現(xiàn),即thionins、displayhevein、plantdefensins、lipoidtransferproteins、IbAMP、knottin-like、moltinghormone和MBP1。與動物源和細菌源抗菌肽比較,植物源抗菌肽對于真菌具有很高的抑殺活性。植物源抗菌肽均含有大量半胱氨酸,并形成2個~6個分子的內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。玉米種子中分離的MBP2和Impatiensbalsamina種子中分離的lb2AMPs,僅含有4個半胱氨酸,可抑制革蘭陽性菌和真菌生長。1.1.3抗菌肽的來源及其結(jié)構(gòu)目前已在軟體動物、節(jié)肢動物(包括昆蟲和甲殼動物)、魚類、兩棲動物、鳥類、哺乳動物包括人類中發(fā)現(xiàn)抗菌肽存在。海洋軟體動物是抗微生物肽的重要來源,根據(jù)目前已發(fā)現(xiàn)的貽貝抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可分為貽貝素(mytilin)、貽貝肽(myticin)、防御素(defensin)和貽貝霉素(mytimycin)等4類,并且均是小分子多肽。毛文君等研究表明,抗菌肽能夠抑制移植性腫瘤的生長,使得小鼠的存活時間延長。昆蟲源抗菌肽是昆蟲遭受刺激或感染后,由血淋巴產(chǎn)生的一類多肽,具備廣譜抗菌活性。依據(jù)結(jié)構(gòu)特點,可將昆蟲源抗菌肽分為4種:①不含半胱氨酸殘基的抗菌肽(代表物為天蠶素);②富含半胱氨酸殘基的堿性多肽(代表物為防御素、死亡素);③富含甘氨酸殘基的抗菌肽(代表物為雙翅肽、攻擊素、麻蠅毒素Ⅱ);④富含脯氨酸殘基的抗菌肽(代表物為蜜蜂肽)。甲殼動物源抗菌肽的研究較少,但大量證據(jù)顯示甲殼動物中存在具備抗微生物活性的物質(zhì)。Jayasankar等從鋸緣青蟹(ScyllaserrataForskal)精液分離到一種能抑制常見海洋細菌的抗菌肽。相建海等從中國對蝦中克隆出抗菌肽基因,并依據(jù)脫氧核糖核酸序列推測其氨基酸序列,從而發(fā)現(xiàn)中國對蝦含有的抗菌肽氨基端富含脯氨酸和甘氨酸。魚源抗菌肽的種類繁多,比較目前已知的魚源抗菌肽的氨基酸序列,其間同源性不大,但結(jié)構(gòu)上存在一定的共性,如分子帶正電,賴氨酸、精氨酸以及疏水氨基酸含量較高,分子可折疊成α螺旋等。Pardaxin是以色列研究者從豹鰨體表黏液分離獲得的抗菌肽,由37個氨基酸殘基組成。目前已從600余種兩棲類皮膚中分離得百余種抗菌肽,例如蛙肽、爪蛙肽等。青蛙和蟾蜍可在應(yīng)激、腎上腺激素、皮膚外傷等因素刺激下釋放由粒狀腺合成的抗菌肽。蛙皮素根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可分為眾多家族,包括gaegurins、brevinvins-1、brevinvins-2、ranalexin、ranatuerins-1、esculentins-1、ranatuerins-2、esculentins-2、palustrin、japonicin-1、nigrocin-2、japonicin-2、rugosins和tempporins。近年來,3種雞源的陽離子抗菌多肽的完全的基因編碼被發(fā)現(xiàn),為研究禽類甚至鳥類具備抗菌活性的多肽奠定了基礎(chǔ)。據(jù)報道,雞類的基因共編碼了β-防御素14種,這些基因分別被命名為Gallinacin1-14,長度為86kb,氨基酸殘基的數(shù)目約有63個~104個,含有許多賴氨酸和精氨酸殘基,以陽離子形式存在。人源抗菌肽發(fā)現(xiàn)較少,主要可分為3類,即防御素、cathecidins、histatins。人源防御素又分為α-防御素和β防御素2類。從人體中性粒細胞中已發(fā)現(xiàn)4種防御素即HNP1~4,且HNP4的濃度要低于HNP1~3。迄今為止,cathecidins僅被發(fā)現(xiàn)在哺乳動物體內(nèi)。除人類只含有1種(LL-37)外,其他各種哺乳動物通常含有多種cathecidins。豬源抗菌肽主要是防御素和cathelicidins家族,擁有廣譜抗菌活性,主要來源于宿主白細胞﹑吞噬細胞和黏膜上皮細胞。豬的上皮β防御素pBD-1是目前在豬體內(nèi)惟一發(fā)現(xiàn)的防御素。重組獲得的pBD-1具有很強的抗菌活性,可抵抗革蘭陽性和陰性菌以及真菌感染。在綿羊至少發(fā)現(xiàn)了10種抗菌肽基因,在綿羊和山羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有2種β防御素存在,即sBD-1~2和GBD-1~2,但其表達范圍不同。已發(fā)現(xiàn)的牛源抗菌肽有30種,主要是氣管上皮抗菌肽(TAP)、牛β防御素(BND)、腸上皮細胞抗菌肽(即腸肽素)、舌抗菌肽(LAP)及牛肽聚糖識別蛋白(BPGRPs)。1.2合成多肽的方法除可通過從自然生物中分離獲得抗菌肽外,還可通過化學合成方法合成。隨著抗菌肽研究的深入進行,人工合成方式已經(jīng)成為以研究為目的的快速獲取目的多肽的重要手段,特別是一些提取工藝復(fù)雜并低效的抗菌肽,且人工合成的多肽被證明在相應(yīng)生物基質(zhì)中同樣具有優(yōu)良的抗菌活性。但由于化學合成方法存在成本很高等問題,目前僅停留在實驗室合成階段。1.3對于化學合成方法的思考從生物體內(nèi)直接提取抗菌肽的難度大,工藝要求高,難以應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn),并且對于某些高等生物或人類源抗菌肽而言難以實現(xiàn)。化學合成方法雖然可作為快速獲得目的多肽的重要手段,但是同樣存在成本較高等問題。所以,利用基因工程方法來生產(chǎn)抗菌肽是一條理想途徑。1.3.1融合蛋白載體的選擇大腸埃希菌的原核表達系統(tǒng)是迄今在基因工程領(lǐng)域中應(yīng)用最多、最完善的表達系統(tǒng)。融合表達可降低抗菌肽對宿主菌的毒性,增加表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性,是抗菌肽常用的表達策略。根據(jù)抗菌肽自身的電荷特性、結(jié)構(gòu)特點構(gòu)建新型表達載體,實現(xiàn)抗菌肽融合蛋白在大腸埃希菌中的高效穩(wěn)定表達,使分離純化步驟得到簡化。WeiQD等以baculoviralpolyhedrin(Polh)為伴侶分子與線形小分子抗菌肽Hal18在大腸埃希菌中融合表達,最終以30%的高回收率得到純度大于90%的重組肽。1.3.2工藝加工蛋白質(zhì)酵母表達體系是目前抗菌肽基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達體系之一(其中主要應(yīng)用釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母),具有基因操作相對簡單、外源蛋白能正確加工與修飾、表達量高、營養(yǎng)要求低、易大量發(fā)酵培養(yǎng)、易純化等優(yōu)點。此外,巴斯德畢赤酵母中的表達產(chǎn)物可直接分泌至胞外,從而可獲得較高的表達量。張素芳等將根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計的magainin基因和cecA-MMIL雜合肽基因分別插入pPICZα-A質(zhì)粒,在巴斯德畢赤酵母中獲得分泌表達,獲得具有抗菌活性的重組肽105mg/L和118mg/L。1.3.3生長迅速,培養(yǎng)條件簡單枯草芽胞桿菌具備良好的分泌性和非致病性,擁有分泌表達外源蛋白的天然優(yōu)勢。其分子遺傳背景清楚,生長迅速,培養(yǎng)條件簡單,可避免表達產(chǎn)物對宿主菌的自身殺滅。李麗等將編碼abaecin的基因插入質(zhì)粒pGplat,成功構(gòu)建的表達質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至枯草芽胞桿菌,經(jīng)過培養(yǎng)等到對雞沙門菌、大腸埃希菌等革蘭陰性菌有抑菌活性的抗菌肽abaecin。1.3.4關(guān)注公眾的關(guān)注以昆蟲桿狀病毒作為表達外源抗菌肽蛋白的載體越來越受到人們的關(guān)注。趙昆等人工合成了抗菌肽融合基因后,利用BAC-TO-BACTM重組桿狀病毒表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)染昆蟲草地夜蛾Sf9細胞,成功表達對大腸埃希菌具有抑菌活性的抗菌肽。1.4消化酶解其他方面的抗菌活性近年來,研究發(fā)現(xiàn)食物蛋白經(jīng)酶解可制備乳源蛋白和非乳源蛋白抗菌肽。酶解法有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過程容易控制等優(yōu)點。本身無抗菌作用的蛋白質(zhì)可以通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)型或者通過酶解方式獲得抗菌活性,且具有抗菌作用的蛋白可以作為具有新功能作用和更強抗菌作用的前體物質(zhì)。目前酶解法制備抗菌肽多數(shù)為消化道蛋白酶類酶解,但其他蛋白酶酶解物同樣具有抗菌活性,如發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶對脫脂乳的酶解物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具備良好的的抑菌活性。PellegriniA等采用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解牛乳α乳清蛋白、卵白蛋白后的產(chǎn)物都具有抗菌活性,而卵清蛋白本身沒有殺菌活性。因此,蛋白酶水解策略將開辟一條新型的大規(guī)模制備安全性高的抗菌肽的低成本道路。2抗菌肽的功能抗菌肽是動物免疫系統(tǒng)中的重要組成部分,其功能具有多樣性。除了廣譜抗菌活性外,抗菌肽還具有抗腫瘤、病毒、原蟲等活性?？咕牡纳飳W功能比較廣泛,主要表現(xiàn)為以下兩個方面:2.1細胞調(diào)濕和抗菌活性在適當抑菌濃度下,抗菌肽能夠與生物膜/壁組成成分或胞內(nèi)細胞器等多種微生物靶位相互作用,前者破壞細胞質(zhì)膜的完整性,后者干擾細胞的正常代謝活動,最終導(dǎo)致細菌死亡。由于在生理相關(guān)條件下,多數(shù)哺乳動物抗菌肽的直接抗菌活性是受到抑制的。GolecM的研究表明,在黏膜表面,生理鹽濃度下,抗菌肽的抗菌活性受到很強的頡頏作用。因此,雖然很多抗菌肽有直接殺菌特性,但是并非所有的抗菌肽都具有直接殺菌特性而對宿主起到保護作用。2.2抗菌肽的生物學活性單純依賴對病原特異性免疫應(yīng)答不足以對抗環(huán)境中數(shù)百萬種的病原微生物接觸,所以具廣譜抗性的抗菌肽扮演了重要的角色。研究證明,在一定生理條件下,抗菌肽具有廣泛的生物學活性,包括在先天性免疫細胞中與炎癥反應(yīng)、先天性免疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)的活性,在單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、T細胞和樹突狀細胞中作為先天性免疫和適應(yīng)性免疫溝通的橋梁。因此,抗菌肽在體內(nèi)除了能以直接殺死病原菌的方式起作用外,更重要的是作為免疫效應(yīng)分子來啟動、調(diào)節(jié)宿主免疫防御體系,從而促進免疫功能來消除感染,保護宿主免受病原微生物侵害。2.2.1抗內(nèi)毒素活性可預(yù)防內(nèi)毒素血癥的發(fā)生2.2.2免疫傾向活動2.2.3抗菌酶對免疫功能的影響2.2.4其他抗凝劑活性3數(shù)據(jù)庫apd關(guān)于抗菌肽的研究不斷深入,多個國家的研究者已建立了多個有關(guān)抗菌肽的數(shù)據(jù)庫。自2002年至今建立了十多個抗菌肽數(shù)據(jù)庫。經(jīng)過多年抗菌肽數(shù)據(jù)庫的不斷更新和補充,可以通過各種數(shù)據(jù)庫及時地了解抗菌肽的研究進展,包括序列比對、分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系、分子改造設(shè)計等。APD(Theantimicrobialpeptidedatabase)是專門收錄抗菌肽的數(shù)據(jù)庫,由美國內(nèi)布拉斯加醫(yī)學中心的Eppley研究所維護。作為專業(yè)的抗菌肽數(shù)據(jù)庫和分析系統(tǒng),目前該數(shù)據(jù)庫現(xiàn)已收錄1528種抗菌肽,主頁將抗菌肽分為四類,分別為抗病毒肽、殺真菌肽、抗癌或腫瘤肽和抗細菌肽。隨著抗菌肽研究領(lǐng)域的增長,新的抗菌肽信息不斷被補充到數(shù)據(jù)庫。ANTIMIC數(shù)據(jù)庫是目前全球最大規(guī)模的抗菌肽數(shù)據(jù)庫,由新加坡國立大學維護,其中收錄了約1700種自然抗菌肽以及各種分析工具,如BLAST,3-D視圖軟件,還有ANTIMIC自建的一個工具界面——Antimicprofilemodule,使用起來相對于APD復(fù)雜。APPDb數(shù)據(jù)庫由愛爾蘭StVincent醫(yī)學院維護。APPDb數(shù)據(jù)庫相對于其他的數(shù)據(jù)庫較小,主頁面就是搜索頁面,沒有附帶分析軟件,其中Pfam數(shù)據(jù)庫專門搜集大量的蛋白家族和結(jié)構(gòu)域,目標是精確的描述蛋白結(jié)構(gòu)域,對于研究蛋白結(jié)構(gòu)的研究者來說極富參考價值。AMSDb數(shù)據(jù)庫原由意大利的Trieste大學創(chuàng)建,現(xiàn)已納入歐洲PAND工程中維護和更新。AMSDb中有基因編碼的抗菌肽及抗菌蛋白,還有暫定的抗菌肽前體,暫定或假設(shè)的抗菌肽是由DNA序列翻譯而來,并非天然源抗菌肽。另外,AMSDb中的抗菌肽是植物和動物源的抗菌肽,沒有微生物源抗菌肽。SAPD(Syntheticantibipticpeptidesdatabase),由芬蘭的DavidWade創(chuàng)建,專門記錄人工合成的抗菌肽。在數(shù)據(jù)庫中擁有許多人工合成的抗菌肽序列結(jié)構(gòu)、活性、藥物試驗、多肽設(shè)計等寶貴資料。CyBase(Thedatabaseofcyclicproteins),由澳大利亞昆士蘭大學分子生命科學院管理,專門研究環(huán)肽類的環(huán)狀蛋白序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。Defensins數(shù)據(jù)庫是指DEFENSINSKnowledgebase,是一個Manuallycurateddatabase,且專門提供防御素家族抗菌肽的信息資源,目前版本的數(shù)據(jù)庫全面收集了363種防御素,記錄了每一種防御素所包含的序列、結(jié)構(gòu)和活性信息。PenBase(Penaeidindatabase)是專用于penaeidins的curated數(shù)據(jù)庫。PenBase提供關(guān)于penaeidin屬性、功能、多樣性和命名原則的綜合信息。PenBase包含由小群或蝦種類列出所有已知的penaeidins抗菌肽的一個數(shù)據(jù)庫部分。Peptaibol數(shù)據(jù)庫(Peptaiboldatabase)是專門收集peptaibols的抗菌肽數(shù)據(jù)庫,生物信息學資源來自英國倫敦大學Birkbeck學院。隨著抗菌肽研究的深入進行,研究者需要一個專業(yè)的專門的存儲抗菌肽的數(shù)據(jù)庫,以便整合抗菌肽信息資源。目前有關(guān)抗菌肽數(shù)據(jù)庫已超過10個,今后這一數(shù)字還將會增加。4gainin,colib盡管一些具備較好的體外抗菌活性的抗菌肽已進入臨床超過10年有余,如magainin,protegrin,indolicidin等,但仍存在諸多問題,限制其發(fā)展和應(yīng)用。真正將抗菌肽從實驗室推向市場,將抗菌肽基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化成產(chǎn)業(yè),可能還要面臨許多挑戰(zhàn),必須繼續(xù)深入研究以下幾個問題。4.1抗菌肽的合成抗菌肽大規(guī)模臨床應(yīng)用的最首要的問題是高生產(chǎn)成本。其一,抗菌肽在生物體內(nèi)天然含量極少,天然資源有限;其二,抗菌肽分子質(zhì)量小,提取步驟煩瑣且效率低,工藝要求高;其三,化學合成法成本高,價格昂貴。而通過基因工程在工程菌中直接表達抗菌肽基因,易被蛋白降解,且產(chǎn)物可能對宿主具有毒性,從而影響基因的高水平表達。如何提高抗菌肽的產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本等問題成為目前抗菌肽生產(chǎn)實踐應(yīng)用中的瓶頸。Roche公司采用固相-液相結(jié)合的方法實現(xiàn)噸級生產(chǎn)的一種HIV結(jié)合抑制肽——T-20。Novozyme公司報道其利用真菌表達系統(tǒng)表達了符合臨床給藥要求的高產(chǎn)量及高活性plectasin,plectasin是第一個具有臨床應(yīng)用潛力的真菌防御素,動物試驗證實了其在治療細菌性腹膜炎和肺炎的治療效果。4.2潛在的致畸性問題抗菌肽是否會成為一種強致敏原,抗菌肽用于人體后是否還有理想的活性,抗菌肽是否有潛在的致畸性或致癌性等一系列問題都有待于進一步研究。另外,由于許多天然抗菌肽都具有溶血性而不利于其在動物和人體的臨床應(yīng)用。通過改造抗菌肽的結(jié)構(gòu)使之既保持抗菌活性又喪失毒副作用,是一種克服抗菌肽毒副作用的有效方法。4.3抗菌類抗菌肽的合成抗菌肽的多樣性及其獨特作用機制的差異預(yù)示著天然細菌群體對其產(chǎn)生抗藥性十分困難。不過自然界總存在著一定的病原微生物,由于十分穩(wěn)定的細胞膜結(jié)構(gòu)或功能性特點使之具有天生的耐藥性。目前已經(jīng)證明金黃色葡萄球菌除可分泌蛋白酶降解防御素和一些人源抗菌肽產(chǎn)生耐藥性外,還可以通過調(diào)節(jié)vraDE和vraSR改變膜的轉(zhuǎn)運作用而產(chǎn)生對蛙類抗菌肽temporinL和dermaseptinK4-S4的耐藥性。這表明抗菌肽在臨床應(yīng)用時,也有可能導(dǎo)致耐藥細菌的產(chǎn)生,盡管其機率比傳統(tǒng)抗生素而言小得多,但也提醒了我們在用抗菌肽進行治療時應(yīng)進行嚴格的控制,以避免耐藥性的出現(xiàn)。4.4抗菌肽的生理作用蛋白質(zhì)類物質(zhì)在體內(nèi)涉及到許多酶化學反應(yīng),抗菌肽經(jīng)口服或注射途徑進入體內(nèi)后,有可能被體內(nèi)的蛋白水解酶降解而使其抗菌活性降低,也可能通過與體內(nèi)某些蛋白質(zhì)結(jié)合最終使其喪失抗菌活性。設(shè)計開發(fā)同時具有抗菌活性與胰蛋白酶抑制劑活性的雙功能多肽,為解決抗菌肽作為替代抗菌藥物在體內(nèi)使用遇到的蛋白酶水解問題提供了新的方法。此外,抗菌肽作為藥物,對其藥效學及藥物代謝動力學的研究還存在不足,蛋白質(zhì)類的抗菌肽在生產(chǎn)、保存、運輸、給藥時極易變性失活,如何保持其活性也是需要進