基因工程的基本操作程序課件高二上學期生物人教版選擇性必修

理論基礎DNA是遺傳物質的證明DNA雙螺旋結構和中心法則的確立遺傳密碼的破譯技術保障基因工程工具的發(fā)現(xiàn)和應用

限制性核酸內切酶

DNA連接酶基因載體(如質粒)一、基因工程的誕生和發(fā)展二、基因工程的概念

基因工程是指在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞，使重組基因在受體細胞中表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物的技術?；蚬こ逃址QDNA重組技術?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對象操作水平原理基本過程結果DNA重組技術體外基因DNA分子水平基因重組剪切→拼接→導入→表達人類需要的基因產(chǎn)物優(yōu)點定向改造生物性狀克服遠緣雜交不親和障礙，育種周期短（一）限制性核酸內切酶（簡稱限制酶）含義：主要從原核生物中分離得到來源：磷酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵

作用部位：有專一性(特異性)。即一種限制酶只能識別一種特定核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子。作用特點：產(chǎn)生黏性未端、平末端

作用結果：小結識別序列長度：大多數(shù)是6個核苷酸序列三、基因工程的工具（二）DNA連接酶——“分子縫合針”1.作用：CGGCCGTTAAAATTGCTATA具有相同黏性末端的兩個DNA片段連接起來，形成重組DNA分子。3.結果：

將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵（無特異性）。作用原理：催化磷酸二酯鍵的形成DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質化學本質不同點模板作用對象

作用結果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要模板需要DNA的一條鏈為模板形成完整的DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制只能將單個脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵1.作用：2.種類：（三）基因進入細胞的載體——分子運輸車作為運載工具，將外源基因送入受體細胞。質粒（最常用）、λ噬菌體的衍生物和某些動植物病毒3.條件：⑴能在宿主細胞內自我復制并穩(wěn)定地保存⑵有一個或多個限制酶切點，可使外源基因插入其中⑶具有某些遺傳標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。⑷對受體細胞無害

(5)大小適宜

實際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蚧蚬こ蘐hebasicoperatingproceduresofgeneticengineeringy從社會中來Fromsociety普通棉花轉基因抗蟲棉將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲蛋白基因轉入普通棉花我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。如何能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種呢？從社會中來Fromsociety培育轉基因抗蟲棉的簡要過程蘇云金桿菌

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因導入與載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲?。ê诵模〣t基因基因工程的實施過程獲取目的基因構建基因表達載體導入目的基因檢測和鑒定目的基因一、獲得目的基因人們感興趣而需要的特定基因，也叫外源基因。2.獲取目的基因的方法：①從基因文庫中獲?、诶肞CR技術擴增

③人工合成1.目的基因：基因較小，核苷酸序列已知基因通常是有遺傳效應的DNA片段AgeneisusuallyapieceofDNAthathasageneticeffectDNA片段基因1基因2基因3放大非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)：能轉錄相應的mRNA，進一步編碼（翻譯）出蛋白質的DNA區(qū)段。非編碼區(qū)：不能轉錄為相應的mRNA，不能編碼蛋白質的區(qū)段。原核細胞的基因結構(補充內容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質。：編碼蛋白質,連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞基因結構②調控遺傳信息表達,上游有啟動子，下游有終止子真核細胞的基因結構（補充內容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細胞基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列①不編碼蛋白質。②調控遺傳信息表達,上游有啟動子，下游有終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子信使RNA成熟的信使RNA終止子轉錄剪切拼接翻譯蛋白質反轉錄法構建的真核生物的CDNA文庫里不含啟動子和終止子真核細胞基因編碼區(qū)中的內含子不編碼蛋白質，但表達時是否轉錄？將此mRNA逆轉錄合成DNA，那么合成的這個DNA與原來的DNA是否一樣？1、從基因文庫中獲?。?）基因文庫的概念:

先用酶切等方法將某種生物細胞的整個基因組DNA片段切割成大小合適的片段，再將這些片段分別與載體連接起來,導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫（2）

基因文庫的種類:基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部

分基因，如：cDNA文庫基因組文庫VScDNA文庫基因組文庫文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組文庫中的真核基因含有內含子，而原核細胞沒有內含子剪切系統(tǒng)，所以基因組文庫中的真核基因不易在原核細胞中正常表達。動植物細胞的內含子剪切系統(tǒng)也有差異，所以動物基因組文庫中的基因不易在植物細胞中正常表達，反之亦然。思考、為什么基因組文庫中只有部分基因可以在物種間進行基因交流？例題：下列關于cDNA文庫和基因組文庫的說法中，不正確的是

(

)A．cDNA文庫中只含有某種生物的部分基因，基因組文庫中含有某種生物的全部基因B．如果某種生物的cDNA文庫中的某個基因與該生物的基因組文庫中的某個基因控制的性狀相同，則這兩個基因的結構也完全相同C．cDNA文庫中的基因沒有啟動子D．一種生物的cDNA文庫可以有許多種，但基因組文庫只有一種B2、利用PCR技術擴增PCR簡介

1.概念：PCR全稱為_______________，

是一項在生物__復制____

_______的核酸合成技術聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段2.原理：利用

的原理，將基因的核苷酸序列不斷加以復制，使其數(shù)量呈

方式增加。DNA雙鏈復制指數(shù)PCR技術—聚合酶鏈式反應3.過程變性退火延伸_____________________目的基因的篩選與獲取——PCR的過程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR第1步：變性5

′-3

′--3

′-5

′5

′-3

′--3

′-5

′當溫度為94℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈。5

′--3

′-5

′3

′-第2步：復性當溫度下降到55℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。目的基因的篩選與獲取——PCR的過程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR5

′--3

′-5

′3

′-第2步：復性什么是引物？為什么需要引物？目的基因的篩選與獲取——PCR的過程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR5

′--3

′-5

′3

′-第3步：延伸5

′--3

′-5

′3

′-5

′--3

′-5

′3

′-當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。目的基因的篩選與獲取——PCR的過程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應模板，經(jīng)過變性、復性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應模板，經(jīng)過變性、復性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’變性（解旋為單鏈）退火（引物與單鏈互補結合）延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補的DNA雙鏈）重復循環(huán)3.過程聚合酶鏈式反應——過程歸納Polymerasechainreaction——Theprocessofinduction4.條件模板引物脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合緩沖Taq酶激活劑5.前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。6.結果：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。DNA在體內的半保留復制

條件：模板、原料、能量、酶

模板：DNA的兩條鏈（母鏈）

原料：四種游離的脫氧核苷酸

能量：一般由ATP

酶：解旋酶、DNA聚合酶

特點：半保留復制、邊解旋邊復制復習：細胞內DNA復制PCR和DNA的體內復制是否完全相同？PCR技術DNA復制原則原料條件解旋方式場所酶特點結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、引物、酶等DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋體外主要在細核胞內熱穩(wěn)定的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶短時間內形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子PCR技術擴增與細胞中DNA復制的比較半保留復制、全解旋再復制半保留復制、邊解旋邊復制

在80-100℃的溫度范圍內，DNA的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開。

當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈。PCR技術中，解開雙鏈沒有用解旋酶，而是利用的DNA的熱變性和復性的原理。變性：復性：目的基因的篩選與獲取Screeningandacquisitionoftargetgenes3.人工合成法（1）前提：（2）方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學方法直接合成目的基因目的基因的篩選與獲取——人工合成DNA目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成反轉錄法：根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成歸納3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________獲取目的基因的三種方法1、如果知道目的基因兩端的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用____________

2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用________________PCR技術擴增化學方法人工合成構建基因文庫，再從基因文庫中獲取1、PCR技術是一種DNA的擴增技術。在一定條件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以實現(xiàn)DNA的擴增。據(jù)此判斷不合理的是

（

）

A．dATP在DNA擴增中可以提供能量，同時作DNA合成的原料B．dTTP完全水解后產(chǎn)物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖C．DNA擴增過程未加解旋酶，可以通過先適當加溫的方法破壞氫鍵，使模板DNA解旋D．CTP水解脫去兩個磷酸基后是組成RNA的基本單位之一

B例題2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細胞中提取④利用PCR技術⑤利用DNA轉錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D例題3、下列有關PCR技術的說法，不正確的是

(

)A．PCR是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術B．PCR技術的原理是DNA雙鏈復制C．利用PCR技術獲取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列D．PCR擴增中需要解旋酶解開雙鏈DNAD例題4、下列有關獲取目的基因方法的敘述，錯誤的是(

)A．直接分離目的基因的方法的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性B．由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段，一般使用人工合成的方法C．目前人工合成基因的方法主要有兩種，分別是反轉錄法和化學合成法D．PCR技術的原理是DNA復制，需要RNA聚合酶催化DNA合成D步驟獲取目的基因構建基因表達載體(核心)導入目的基因檢測和鑒定目的基因1.2.3.4.1目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因等構建基因表達載體——核心步驟啟動子首端RNA聚合酶轉錄終止子尾端RNA聚合酶轉錄標記目的基因基因表達載體的組成：一般用同一種

酶分別切割載體和目的基因，再用

酶把兩者連接(如圖)。限制DNA連接基因表達載體的構建過程：缺點1：質粒自身環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接【討論】如果只用一種限制酶分別切割目的基因和質粒，再用DNA連接酶處理后會出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？a、b、c、d四個黏性末端相同。思考分析——單酶切的缺點Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestion缺點2：目的基因自身環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接思考分析——單酶切的缺點Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestionabcd限制酶切割DNA連接酶連接反向連接重組DNA缺點3：目的基因與質粒反向連接，造成目的基因不能正確表達。思考分析——雙酶切用兩種限制酶切割質粒和含有目的基因的DNA片段重組質粒限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd黏性末端a與c相同；黏性末端b與d相同。思考分析——雙酶切Thinkinganalysis——Doubleenzyme限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd質粒不會重新環(huán)化目的基因不會被環(huán)化優(yōu)點1優(yōu)點2優(yōu)點3目的基因與質粒不會發(fā)生反向連接確保目的基因與運載體定向連接，減少重組雜物。習題鞏固——用限制酶切割時需注意的事項Exercisestoconsolidate——Pointsneedingattentionwhencuttingwithrestrictionenzyme(1)獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是為了

。但是使用該法缺點是容易發(fā)生

以及

，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

。產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接目的基因與質粒反向連接目的基因、質粒的自身環(huán)化分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運載體(2)獲取一個目的基因需限制酶切割

次,

共產(chǎn)生

個游離的磷酸基團。兩4習題鞏固——用限制酶切割時需注意的事項Exercisestoconsolidate——Pointsneedingattentionwhencuttingwithrestrictionenzyme(3)選擇限制酶切割位點的基本原則：①切割目的基因時：

。②切割質粒時：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個完整的標記基因，便于篩選基因表達載體的構建Constructionofgeneexpressionvector1.下列有關體內DNA復制與PCR技術比較的敘述，

錯誤的是(

)A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實現(xiàn)解旋C.體內DNA復制需要能量，PCR反應也需要能量D.二者遵循的堿基互補配對原則相同B基因表達載體的構建Constructionofgeneexpressionvector2.下列關于基因表達載體的敘述不正確的是()A.啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼B.啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對mRNA的轉錄起調控作用C.標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D.基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別A步驟獲取目的基因構建基因表達載體導入目的基因檢測和鑒定目的基因1.2.3.4.(三)將目的基因導入受體細胞（一）受體細胞：動物細胞、植物細胞、微生物細胞（大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等）。（二）方法：(三)將目的基因導入受體細胞①農(nóng)桿菌轉化法：將目的基因導入

和裸子植物時最常用的方法。雙子葉植物1.導入植物細胞（二）方法：a.土壤農(nóng)桿菌的特點：植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的

化合物，吸引農(nóng)桿菌侵染，其

質粒上的

(可轉移的DNA)可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞的

上。

酚類TiT-DNA染色體的DNAb.方法步驟：

插入Ti質粒的

上→轉入

→導入植物細胞→目的基因插入植物細胞中的

上→目的基因表達。目的基因T-DNA農(nóng)桿菌染色體的DNA核心歸納1.農(nóng)桿菌轉化法中兩次拼接、兩次導入的辨析(1)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。(2)兩次導入：第一次導入是將含目的基因的重組Ti質粒導入農(nóng)桿菌；第二次導入(非人工操作)是將含目的基因的T－DNA導入受體細胞。②基因槍法：將目的基因導入

植物常用的方法。表達載體DNA包裹在微小的金粉粒子或鎢粉粒子表面→用基因槍高速射入_________或組織中→目的基因表達。單子葉受體細胞③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助

進入受體細胞。花粉管通道植物的體細胞花粉卵細胞精子花粉管子房壁（1）番茄為什么通常容易軟化？抗軟化番茄的抗軟化機理是什么？抗軟化番茄的培育

（2）在該項目中，目的基因是什么？其載體是什么？（3）該培育過程運用到哪些生物學技術？2.將目的基因導入動物細胞3.將目的基因導入微生物細胞①方法：感受態(tài)細胞轉化法（Ca2+處理法）②受體細胞：常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌最廣泛。優(yōu)點：繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少、易于培養(yǎng)。Ca2+處理大腸桿菌使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性這種細胞稱為感受態(tài)細胞③過程：感受態(tài)細胞和重組表達載體DNA分子在

中混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子。緩沖液受體細胞植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉化法、花粉管通道法顯微注射技術感受態(tài)細胞法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程以農(nóng)桿菌轉化法為例：將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上↓轉入農(nóng)桿菌中↓導入植物細胞↓整合到受體細胞的DNA上提純含目的基因的表達載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個體Ca2＋處理細胞↓感受態(tài)細胞↓基因表達載體與感受態(tài)細胞混合↓感受態(tài)細胞吸收DNA分子①②③方法：利用標記基因（抗生素抗性基因）進行篩選。篩選含有目的基因的受體細胞步驟獲取目的基因構建基因表達載體(核心)導入目的基因檢測和鑒定目的基因1.2.3.4.(1)檢測目的基因是否插入受體細胞的DNA中：