黃芪多糖對慢性支氣管炎小鼠氣道黏附修復(fù)作用的研究

黃芪多糖對慢性支氣管炎小鼠氣道黏附修復(fù)作用的研究

當(dāng)綠色膿桿菌感染時，應(yīng)采取具體措施，將抗生素的殺菌效果與細(xì)菌的分解分離，以減少內(nèi)毒素的釋放，并減少隨機(jī)對照炎癥反應(yīng)。紅細(xì)胞誘化因子受體（cekr）通過參與體內(nèi)誘導(dǎo)環(huán)境因子家族的調(diào)節(jié)，在抗綠膿桿菌感染中發(fā)揮著作用。中醫(yī)在身體的整體調(diào)節(jié)中發(fā)揮著良好的作用。為探索中西醫(yī)結(jié)合防治慢性支氣管炎(慢支)的途徑,早在10年前,浙江省中醫(yī)呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的專家們就根據(jù)中醫(yī)“扶正固本”和“扶正祛邪”的治療原則,開發(fā)了以黃芪為君藥的扶正補(bǔ)益類中藥慢支固本沖劑,對氣管黏膜上皮抗細(xì)菌黏附進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察及臨床抗感染的研究,證明慢支固本沖劑對慢支模型小鼠受損的氣管黏膜上皮有修復(fù)作用,能抵抗綠膿桿菌的黏附和感染,應(yīng)用于臨床治療慢支患者也獲得了良好的療效。近年來研究表明,黃芪多糖可能是扶正補(bǔ)益類中藥中起以上作用的主要成分,故本研究擬通過動物實(shí)驗(yàn)闡明黃芪多糖拮抗綠膿桿菌的黏附,阻斷感染的作用及機(jī)制,從而證明黃芪多糖是補(bǔ)益類中藥黃芪中起以上作用的主要成分。1不同劑量對黃芪多糖抗綠病理的影響1.1實(shí)驗(yàn)材料:120只2月齡健康昆明(KM)品系小鼠,體重20~22g,雌雄各半,由浙江省中醫(yī)藥研究院提供[許可證號:SYXK(浙)2004-0034]。實(shí)驗(yàn)用綠膿桿菌自患者痰中分離,由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室鑒定,電鏡檢查(銅網(wǎng)法)細(xì)菌具有菌體纖毛、莢膜及偏端單鞭毛。慢支固本沖劑由浙江新光制藥廠提供(批號:050428),臨用時配制成溶液,內(nèi)含生藥51.6g/L;黃芪多糖由浙江大學(xué)材料化學(xué)院提供(批號:050211)。1.2實(shí)驗(yàn)方法:將小鼠稱重后按隨機(jī)數(shù)字表法分組、編號,制備慢支感染綠膿桿菌模型。1.2.1實(shí)驗(yàn)一:取20只,用于觀察慢支感染綠膿桿菌小鼠35d內(nèi)氣管帶菌情況,細(xì)胞定量計(jì)數(shù)方法:菌數(shù)<100個為+;100~500個為++(2+);500~1000個為+++(3+);>1000個為++++(4+)。1.2.2實(shí)驗(yàn)二:取100只,制模后再隨機(jī)分為低、中、高劑量治療組,陽性對照組和陰性對照組5組,每組20只。低、中、高劑量治療組每次分別給予黃芪多糖0.26、0.78和1.56mg;陽性對照組每次給予慢支固本沖劑1ml;陰性對照組每次給予蒸餾水1ml。各組均以灌胃方法給藥或蒸餾水,每日1次,連用10d。1.2.3慢支小鼠模型的復(fù)制:按徐仁寶介紹的二氧化硫(SO2)動力定量刺激法制備模型。SO2濃度為(1.6~2.0)×10-8,每日刺激1h,10d后進(jìn)行病理檢查,出現(xiàn)典型慢支病理改變?yōu)槟Ｐ蛷?fù)制成功。1.2.4慢支感染綠膿桿菌小鼠模型制備:采用細(xì)菌氣溶膠吸入感染法。定時以無菌操作取氣管樣品制成勻漿進(jìn)行細(xì)菌定量培養(yǎng),觀察感染后1、3、5、7、10、15、20、25、30和35d小鼠氣管帶菌情況。1.2.5黃芪多糖的藥效實(shí)驗(yàn):先后取氣管樣品制成勻漿進(jìn)行細(xì)菌定量培養(yǎng)及病理切片,用光學(xué)顯微鏡觀察其氣管黏膜上皮的病變。處死各組的10只慢支感染綠膿桿菌小鼠,常規(guī)消毒,在無菌條件下切開頸部皮膚,分離氣管,取出環(huán)狀軟骨下1mm氣管組織,加入盛有1ml生理鹽水的組織勻漿器中,研碎組織成混懸液,用倍比稀釋法,即每份標(biāo)本取1ml勻漿加生理鹽水9ml,分別稀釋成10、100、1000和10000倍,然后從各濃度稀釋液中取0.1ml分別加在瓊脂平板上,用L棒在瓊脂培養(yǎng)平板上推勻,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)(以上實(shí)驗(yàn)均作雙份平行實(shí)驗(yàn))24h,然后計(jì)數(shù)平板上的菌落作為氣管綠膿桿菌數(shù),并計(jì)算出1ml原液中的菌落形成單位(cfu/ml),以其代表每毫升原液的含菌數(shù)。通過低、中、高劑量治療組含菌數(shù)的多少來表達(dá)不同劑量黃芪多糖抗綠膿桿菌感染作用的差異。另取部分氣管標(biāo)本用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定,按常規(guī)方法進(jìn)行病理切片,在光學(xué)顯微鏡下觀察其氣管黏膜上皮的病變,以病變改善情況來表達(dá)黃芪多糖對慢支感染綠膿桿菌小鼠氣管黏膜上皮有修復(fù)作用。各組取余下的10只慢支感染綠膿桿菌小鼠,先用4℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛進(jìn)行活體氣管和支氣管原位固定,再用鋨酸進(jìn)行雙固定,以制備掃描電鏡觀察的標(biāo)本。然后,取其氣管樣品,用掃描電鏡對其氣管樣品進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)及綠膿桿菌黏附數(shù)的觀察,通過其觀察到的改善情況來表達(dá)黃芪多糖抗綠膿桿菌黏附的作用。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2不同劑量黃芪多糖對慢支固本膠囊慢支感染綠細(xì)胞菌的作用2.1慢支感染綠膿桿菌小鼠35d內(nèi)氣管帶菌時間的考察結(jié)果(表1):未經(jīng)治療的慢支感染綠膿桿菌小鼠氣管帶菌時間可持續(xù)35d以上,說明該慢支感染綠膿桿菌小鼠在35d之內(nèi)完成藥物實(shí)驗(yàn)都是有效的。2.2黃芪多糖對慢支感染綠膿桿菌小鼠氣管細(xì)菌培養(yǎng)菌落形成單位數(shù)的影響(表2):陰性對照組慢支感染綠膿桿菌小鼠因吸入的細(xì)菌黏附于病損的纖毛上皮不能被排出,因而在氣管內(nèi)不斷繁殖,造成長期帶菌。給低、中劑量黃芪多糖的慢支感染綠膿桿菌小鼠,其病損纖毛上皮未被完全修復(fù),吸入的細(xì)菌黏附于病損的纖毛上皮不能被完全排出,故帶數(shù)目不等的綠膿桿菌;給高劑量黃芪多糖及慢支固本沖劑的慢支感染綠膿桿菌小鼠,其病變氣管纖毛上皮已基本恢復(fù)健康,故吸入的細(xì)菌極少黏附或不黏附。這正是黃芪多糖能抵抗綠膿桿菌感染的機(jī)制所在。2.3黃芪多糖對慢支感染綠膿桿菌小鼠氣管黏膜上皮的修復(fù)作用:光鏡下觀察,彩色插頁圖1示正常小鼠氣管黏膜上皮的細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)。陰性對照組小鼠氣管黏膜內(nèi)腺體增多,伴有黏液化現(xiàn)象,大量以淋巴細(xì)胞為主的慢性炎性細(xì)胞浸潤,血管擴(kuò)張充血、水腫(彩色插頁圖2)。低劑量治療組小鼠氣管黏膜上皮局部有鱗狀上皮細(xì)胞化生,固有膜內(nèi)結(jié)締組織增生(彩色插頁圖3)。中劑量治療組小鼠上述病變顯著好轉(zhuǎn),接近正常小鼠氣管壁結(jié)構(gòu)(彩色插頁圖4)。高劑量治療組和陽性對照組小鼠病變基本消失,與正常小鼠的氣管壁比較很少有差別(彩色插頁圖5,圖6)。說明黃芪多糖對慢支病損的氣管黏膜上皮有修復(fù)作用,且與其劑量有關(guān)。2.4黃芪多糖對慢支感染綠膿桿菌黏附作用的影響:電鏡下觀察,陰性對照組小鼠氣管黏膜上皮表面纖毛斷離,結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞;可見到較多綠膿桿菌黏附于缺損的氣管黏膜上皮表面(彩色插頁圖7,圖8)。而給予慢支固本沖劑及高劑量黃芪多糖治療的慢支感染綠膿桿菌小鼠,除少數(shù)有少量的綠膿桿菌黏附外,大部分氣管黏膜上皮纖毛完整,未見有綠膿桿菌黏附于它的表面(彩色插頁圖9,圖10),而給予低、中劑量黃芪多糖治療的慢支感染綠膿桿菌小鼠氣管黏膜上皮可以見到數(shù)量不等的綠膿桿菌黏附于缺損黏膜上皮表面(彩色插頁圖11,圖12)。表明黃芪多糖能使缺損的黏膜上皮修復(fù),從而抵抗綠膿桿菌在呼吸道的黏附,其藥效與劑量有關(guān);這也進(jìn)一步闡明了黃芪多糖拮抗綠膿桿菌在呼吸道的黏附,阻斷感染的作用及機(jī)制,從而證明黃芪多糖是補(bǔ)益類中藥黃芪中起以上作用的主要成分。3細(xì)菌黏附學(xué)說慢支為呼吸系常見病,繼發(fā)感染的發(fā)病率與病死率均較高。根據(jù)慢支咳、痰、喘的主要臨床表現(xiàn),可歸于祖國醫(yī)學(xué)的“內(nèi)傷咳嗽”、“痰飲”、“喘證”等范疇。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為,人體健康的維持取決于機(jī)體正氣的強(qiáng)弱,正氣虛損可引起臟腑功能失調(diào),其衛(wèi)外無力致使外邪侵襲,導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。誠如《內(nèi)經(jīng)》中所云,“正氣存內(nèi),邪不可干”,“邪之所湊,其氣必虛”。因此,祖國醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)扶正固本、扶正祛邪,增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力,以抵御外邪的侵入。臨床上對慢支等呼吸系感染性疾病虛證患者,常根據(jù)扶正祛邪的原則給予補(bǔ)益方劑能收到良效。以前人們常認(rèn)為,這些補(bǔ)益方藥作用于機(jī)體的免疫機(jī)制,從而間接起到了治療的作用。近幾十年來在國外出現(xiàn)了根據(jù)細(xì)菌感染理論提出的黏附學(xué)說,該學(xué)說認(rèn)為,在細(xì)菌對人體的感染過程中,細(xì)菌黏附于上皮細(xì)胞是整個感染過程的第一步,只有在黏附的基礎(chǔ)上,細(xì)菌才能進(jìn)一步在組織表面定居、繁殖,從而形成炎癥;黏附分子參與多種病原微生物如耶爾森菌、幽門螺旋桿菌、巨細(xì)胞病毒、鼻病毒以及艾滋病病毒等對機(jī)體的侵襲或宿主細(xì)胞感染,從而也為細(xì)菌性疾病的治療和預(yù)防開辟了一條非抗生素治療的、廣譜的、全新的途徑。此前國外對抗感染的研究大多著眼于抗生素對細(xì)菌的作用,隨著細(xì)菌黏附理論的發(fā)展,對黏附素的研究,以及亞致死劑量抗生素、封閉抗體的應(yīng)用都取得了一定的進(jìn)展,如Rogers等對慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者所進(jìn)行的“肺的營養(yǎng)”研究證實(shí)提高了機(jī)體的抗感染能力。祖國醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)扶正固本、扶正祛邪,因此在慢性呼吸系疾病患者急性感染控制后,采用扶正補(bǔ)益類方劑持久、穩(wěn)定地恢復(fù)呼吸道屏障功能,是防治呼吸道感染的有效途徑之一。由此設(shè)想,沒有殺/抑菌作用的補(bǔ)益類中藥對慢支等呼吸道感染疾病虛證患者有防治作用,其機(jī)制不僅在于補(bǔ)益方藥能提高機(jī)體的免疫功能,還可能阻斷細(xì)菌對人體組織上皮細(xì)胞的黏附,從而阻止感染的發(fā)生,即有抗細(xì)菌黏附的作用。本研究再次證明:①綠膿桿菌不能黏附于健康小鼠完整的氣管黏膜上皮,故健康小鼠不受感染;但可黏附于慢支模型小鼠病損的氣管黏膜上皮,繼而引起感染。②慢支固本沖劑對慢支模型小鼠受損的氣管黏膜上皮有修復(fù)作用,能抵抗綠膿桿菌的黏附和感染。③慢支固本沖劑治療慢支患者有良好的效果。慢支固本沖劑由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、當(dāng)歸四味中藥組成,黃芪為君藥,系古代名方玉屏風(fēng)散加當(dāng)歸而成,近年來的研究表明,多糖可能是扶正補(bǔ)益類中藥中起上述作用的主要成分,本研究證實(shí)了黃芪多糖能拮抗綠膿桿