食品中4種肉類的多重pcr鑒別方法的建立與優(yōu)化

食品中4種肉類的多重pcr鑒別方法的建立與優(yōu)化

0復合pcr檢測其他種類豬肉中的物種[研究意義]肉與鮮肉混合是中國食品質量控制面臨的主要挑戰(zhàn)之一。不法企業(yè)在利益的驅使下使用相對廉價的豬肉、雞肉等肉類原料,冒充牛肉、羊肉制品進行銷售,嚴重侵犯了消費者的合法權益。然而,傳統(tǒng)的依靠感官與經(jīng)驗的肉類形態(tài)學鑒別手段已遠不能滿足對肉制品摻假現(xiàn)象進行控制與監(jiān)管的需要。因此,對于中國肉制品市場占有率較高的豬肉、牛肉、羊肉和雞肉,建立科學、準確、快速、高通量的篩選方法已十分必要。【前人研究進展】以聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的技術已逐步成為了肉類種屬鑒定的核心方法。許多學者根據(jù)不同物種基因序列的差異位點設計特異性引物,利用PCR反應實現(xiàn)食品中特征基因片段的指數(shù)級擴增,繼而通過電泳檢測鑒別食品中可能的物種來源。近年來,實時熒光PCR技術的飛速發(fā)展大大提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度,并使得肉類含量的定量溯源成為可能。在目標基因選擇方面,動物線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性,且由于拷貝數(shù)多而在食品加工過程未完全降解,因此其多態(tài)性位點是設計肉類成分定性檢測的首選靶點。目前,根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設計物種特異性引物,所建立的PCR與實時熒光PCR方法已有大量報道,且進入了中國權威的檢測技術標準。Girish等基于線粒體12SrRNA基因,應用PCR-RFLP成功鑒定了牛肉、水牛肉、綿羊肉及山羊肉。Dooley等基于線粒體細胞色素b基因,分別建立了牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和火雞肉的實時熒光定量PCR檢測方法。方法設計方面,在同一反應體系中加入多對引物的多重PCR技術應用于食品中動物源性成分的鑒別,可提高檢測效率與檢測通量。Ghovvati等基于線粒體12SrRNA和16SrRNA基因應用多重PCR技術對反芻動物、家禽和豬進行鑒。Soares等應用雙重PCR在豬肉中成功檢測到禽肉。Fajardo等采用多重PCR技術成功鑒定出了3種鹿的亞種。在中國,陳文炳等應用單重PCR和雙重PCR能分別對食品中豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等肉類成分進行鑒定?！颈狙芯壳腥朦c】在實際檢測中,尤其在需要對大量的食品樣本進行肉類摻假的篩選時,提高檢測效率與通量對于及時監(jiān)管十分重要。以多重PCR為基礎,建立多種肉類成分同時鑒別的快速檢測技術是提高效率的有效途徑之一。然而目前,針對中國肉類摻假現(xiàn)狀,應用多重PCR的肉類快速鑒別與篩選技術尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究根據(jù)動物線粒體細胞色素b基因的差異性位點,利用正向引物共用、反向引物特異的策略,建立用于豬肉、牛肉、羊肉、雞肉4種肉類DNA快速檢測的UP-M-PCR體系。1材料和方法試驗于2010年12月—2011年4月在南京農業(yè)大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室進行。1.1試驗材料生(熟)豬肉、生(熟)牛肉、生(熟)羊肉、生(熟)雞肉、生馬肉、生驢肉、鯽魚、大豆粉等均購于南京市農貿市場。1.2細胞、動物組織和生化試劑PCR儀(Veritee96-well,美國ABI公司);核酸電泳儀(SUB-cellGT,美國Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(UniversalHoodⅡ,美國Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(3-18K,美國Sigma公司)。血液、細胞和動物組織的基因組DNA提取試劑盒購自Qiagen公司;ExTaqDNA聚合酶及反應緩沖液、dNTP、MgCl2、DNA分子量MarkerDL1000、電泳上樣緩沖液等PCR生化反應試劑購自寶生物工程(大連)有限公司;電泳級瓊脂糖購自南京生興生物公司;引物合成、DNA測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。1.3測試方法1.3.1dna的提取分別使用DNeasy組織細胞DNA提取試劑盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉中的總DNA。其中,DNeasyDNA提取試劑盒法按說明書操作;SDS-蛋白酶K法參照《分子克隆》第三版;CTAB-蛋白酶K法則參照Dooley等的方法。SDS-蛋白酶K法與CTAB法均使用氛/氯仿抽提進行核酸純化。50mg樣品的總DNA均溶解于100μLTE緩沖液中,于OD260/280測定吸光度值,計算DNA濃度和純度。1.3.2pcr引物設計引物的設計與特異性位點的選擇依照Matsunaga等的方法并作適當修改。根據(jù)豬(GenBank登錄號:GU135833.1)、牛(GenBank登錄號:HQ184045.1)、山羊(GenBank登錄號:AB044308.1)、綿羊(GenBank登錄號:HM236185.1)、雞(GenBank登錄號:GU261717.1)線粒體細胞色素b基因序列,采用正向引物共用、反向引物特異的策略,設計兩套各5條多重PCR引物,第一套引物長27—28bp,第二套引物長18—20bp,兩套引物使用相同的種屬特異性位點,即第二套引物由第一套引物截短而得到。兩套引物在線粒體基因組中的結合位置見圖1,引物序列、Tm值與擴增片段大小見表1。1.3.4檢測特異性驗證按照1.3.3的反應體系及優(yōu)化的反應條件,分別使用4種目標肉類DNA及其兩兩等比例混合物、魚肉、馬肉、驢肉和大豆來源的DNA對兩套引物的檢測特異性進行驗證與比較。1.3.5多重pcr方法的靈敏度將100ng·μL-1的4種目標肉類DNA10倍梯度稀釋,使用1.3.3的反應體系及優(yōu)化的反應條件,分別針對豬肉、牛肉、羊肉和雞肉4種肉類考察多重PCR方法的靈敏度。1.3.6t載體組合分離主導型高效聚合酶鏈反應物的合成使用優(yōu)化的多重PCR方法對豬肉、牛肉、羊肉和雞肉4種目標肉類DNA進行擴增,產(chǎn)物電泳后割膠回收純化,參照《分子克隆》第三版對純化產(chǎn)物進行T載體連接、轉化、克隆篩選及鑒定,并委托測序。測序結果與GenBank上的已知序列進行比對。1.3.7用于市場領導的實際檢驗使用優(yōu)化的多重PCR方法對市售的80份各類肉制品進行的鑒定,驗證方法的實用價值,并了解市場上肉類摻假的真實狀況。2結果2.1不同方法對鮮食中dna提取效果的影響分別使用DNeasy試劑盒、經(jīng)典的SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法提取豬肉、牛肉、羊肉和雞肉4種肉類的總DNA。表2列出了應用3種方法對生鮮肉提取的結果。SDS-蛋白酶K法與DNeasy試劑盒法所提取的DNA濃度處于同一個數(shù)量級,SDS-蛋白酶K法在濃度與純度方面均略優(yōu)。CTAB-蛋白酶K法由于對肌肉組織消化效果較差,因此DNA提取效率顯著偏低。相比于SDS-蛋白酶K法,DNeasy試劑盒大大節(jié)省了提取時間,且無需使用苯酚、氯仿等有毒試劑,綜合考慮提取效率及試驗安全性,后續(xù)試驗中均采用DNeasy試劑盒提取食品中的總DNA。2.2確定豬肉和豬肉的最佳配比通過梯度PCR試驗,綜合反應特異性與產(chǎn)物量,確定使用兩套引物的最佳退火溫度均為52℃。分別使用4種目標肉類DNA及其兩兩混合物、魚肉、馬肉、驢肉、大豆來源的DNA為模板,對兩套引物進行特異性驗證及比較(圖2)。由圖2可見,使用兩套引物針對4種目標肉類DNA進行檢測,均在設計位置能觀察到特異性條帶,未見明顯非特異性擴增,且與魚肉、馬肉、驢肉和大豆DNA均無交叉反應。然而,第二套引物在檢測目標肉類兩兩混合的DNA時,當牛肉DNA與羊肉或豬肉DNA中的一種混合,牛肉成分均未被檢出。這可能是由于第二套引物過短,與不同模板正確配對的堿基比例相差較大,在多重PCR體系中優(yōu)先與羊肉或豬肉DNA結合,從而影響了檢測的特異性與穩(wěn)定性。對南京農業(yè)大學食品科技學院肉品加工與質量控制教育部重點實驗室制取的4種肉類的熟制品進行檢測,特異性試驗結果相同。同時,檢測人為制成的生鮮肉兩兩混合物提取的DNA,與DNA兩兩混合物PCR的結果相同。因此,在后續(xù)試驗中,將僅使用第一套引物進行引物靈敏度試驗和樣本的實際鑒定。2.3pcr法測靈敏度將100ng·μL-1豬肉、牛肉、羊肉和雞肉來源的DNA模板原液進行10倍梯度稀釋,使用第一套引物對之進行檢測以考察方法的靈敏度(圖3)。由圖3可見,目標DNA稀釋103倍后,使用多重PCR法進行檢測,均仍可觀察到微弱的特異性擴增。因此,檢測的靈敏度可達皮克級。對于4種目標肉類DNA兩兩混合物模板的檢測及熟制品檢測,靈敏度試驗結果相同。2.4同源性的確定將2.2中4種目標肉類的特異性條帶回收純化,純化產(chǎn)物連接入T載體并委托測序,將測序結果與GenBank中的已知序列進行比對。比對結果顯示,豬的測序結果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號分別為GU135833.1、GU135832.1、GU135798.1)、牛的測序結果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號分別為HQ184045.1、HQ184038.1、HQ184037.1)、山羊的測序結果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號分別為AB044308.1、AB004073.1、AB004069.1)、綿羊的測序結果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號分別為HM236185.1、HM236184.1、HM236177.1)、雞的測序結果與已發(fā)表序列(GenBank登錄號分別為GU261717.1、GU261715.1、GU261714.1)的同源性均在99%以上,與預期基本一致,確定分別為豬肉、牛肉、羊肉和雞肉成分。2.5樣本的分類和檢測結果使用上述多重PCR方法對市售的80份食品樣本進行了4種肉類的鑒定。樣本的分類與檢測結果見表3。由表3可知,肉類摻假普遍存在于調理生肉制品、醬鹵肉、干制品和火腿制品等各類食品中,摻假率達16.3%。3pcr檢測其他種類豬肉的最佳條件在動物源性成分鑒定中,多重PCR技術是較為常用的鑒定方法之一。本試驗在參考前人研究的基礎上,基于物種間線粒體細胞色素b基因的序列差異,建立了4種常見肉類成分快速檢測的通用引物多重PCR方法。多重PCR是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物,同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。以多重PCR為基礎的肉類成分鑒別技術具有檢測通量高、儀器設備簡單、操作方便且檢測費用節(jié)省的優(yōu)點,但由于其需要在同一PCR體系里加入多對特異性引物,復雜的PCR體系易造成方法靈敏度降低以及對不同目標序列擴增效率不一致,從而使得相關方法的推廣與標準化受到限制。本研究采用了正向引物通用、反向引物特異的UP-M-PCR設計策略,即應用包含5條引物的多重PCR體系實現(xiàn)4個物種的鑒別,最大限度地避免引物數(shù)量過多造成的交叉干擾。目前,通用引物多重PCR方法對食品中大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌及水中脊髓灰質炎病毒、柯薩奇B組病毒和?？刹《镜饶c道病毒的檢測已有報道,用于肉類品種鑒定在中國尚屬首次。相比于Soares等鑒別動物源性成分的單重與雙重PCR技術,本研究應用5條引物同時實現(xiàn)對4種肉類成分的鑒別,大大提高了檢測效率和檢測通量。與Ghovvati等應用多重PCR對反芻動物、家禽和豬進行鑒定相比,本研究主要針對中國肉類摻假現(xiàn)狀進行試驗研究,具有較顯著的現(xiàn)實意義和應用價值;相比于中國出入境檢驗檢疫標準SNT/2051-2008中應用實時PCR對食品、化妝品和飼料中牛、羊、豬源性成分進行鑒別,本研究具有檢測儀器簡單、檢測成本節(jié)省、檢測通量較高等優(yōu)點,更適合于對大量肉制品摻假的鑒別篩選。影響多重PCR反應效果的因素很多,其中引物設計直接影響PCR擴增的特異性與靈敏度;另外,PCR體系的優(yōu)化可以使多重PCR得到最佳效果。一般認為,在一定范圍內,引物序列越長,PCR反應的特異性越高、靈敏度越低。因此,在方法設計中,選擇合適長度的多重PCR引物序列,從而獲得最優(yōu)化的檢測靈敏度、特異性及各目標片段擴增均一性將尤為關鍵。對此,本研究基于相同的特異性位點設計了長度不同的兩套引物,試驗結果顯示,使用長度為27—28bp的第一套引物時,在優(yōu)化的反應條件下,對4種目標肉類DNA及其兩兩混合物的檢測表現(xiàn)出良好的特異性與靈敏度,靈敏度達到皮克級。當把引物片段長度降低到18—20bp時,對目標肉類混合物的檢測表現(xiàn)出擴增效率的差異,牛肉成分難以被檢出。在本研究所使用的肉中總DNA提取方法中,Qiagen公司的DNeasyDNA提取試劑盒是當前組織細胞DNA提取最受肯定的商品化技術之一,而SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法均是組織中總DNA提取的經(jīng)典方法。CTAB-蛋白酶K法由于CTAB難以完全裂解肌肉組織而導致DNA提取效率顯著偏低;DNeasy試劑盒法與SDS-蛋白酶K法均采用含SDS的緩沖液裂,均可有效地裂解肌肉細胞,但DNeasy試劑盒法中純化柱對核酸的回收率低于酚/氯仿抽提,考慮到提取效率與安全性,本研究優(yōu)先采用DNeasy試劑盒提取肉制品中的總DNA?？紤]到肉制品摻假的實際往往是使用一種廉價肉類代替或摻入另一種價格相對較高的肉類,因此在同一多重PCR反應體系中針對多種肉類同時鑒定方面,本研究重點考察了目標肉類兩兩混合時的檢測特異性。進一步的試驗表明,本文建立的多重PCR技術對于同時鑒定目標肉類中的3或4種也具備良好的效果。同時,鑒于山羊肉與綿羊肉的價格區(qū)別不大,市場上此類摻假較少,本研究使用了山羊與綿羊的通用引物作為羊肉鑒定的特異性引物。4定量pcr檢測成本建立了靈敏、可靠的4種肉類成分快速鑒定的多重PCR方法,相比于現(xiàn)有標準中的單重PCR技術提高了篩選通