腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2對神經(jīng)元軸突生成的影響

腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2對神經(jīng)元軸突生成的影響

促進軸突生成不僅可以防止ad患者大腦中神經(jīng)軸突的退行性變，而且可以促進退行性變。神經(jīng)元極性是指絕大多數(shù)神經(jīng)元存在一個長的軸突和幾個短的樹突。胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)是研究神經(jīng)元極性的良好模型。培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的突起中一個突起發(fā)展成為長的軸突,剩下的突起則形成短的樹突。神經(jīng)元發(fā)生發(fā)展到最后成熟需要經(jīng)歷6個階段:神經(jīng)元自圓形細胞球開始,胞體周圍開始伸出偽足(培養(yǎng)4h),之后偽足逐漸形成小的突起(培養(yǎng)12～24h),神經(jīng)元突起繼續(xù)生長,眾多突起中有一個突起迅速生長成為軸突時,我們稱該神經(jīng)元極性已經(jīng)形成(培養(yǎng)24～48h)。因此,神經(jīng)元極性形成的標志就是其軸突的生成。雖然軸突的運輸模式及其正常的生理功能已經(jīng)被研究得較為清楚,但有關(guān)神經(jīng)元軸突生成的相關(guān)機制還知之甚少。調(diào)節(jié)微管的腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(CRMP-2)廣泛高表達于發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng),是CRMP家族5種亞型之一。海馬神經(jīng)元處于生長狀態(tài)的軸突含有豐富的CRMP-2,其在軸突生長錐中主要以非磷酸化CRMP-2活性形式存在。國外研究發(fā)現(xiàn),CRMP-2與管蛋白異二聚體相互作用而促進微管的聚集;CRMP-2通過與Numb以及重組肌絲的相互作用調(diào)節(jié)某些特異的黏附分子如L1的內(nèi)吞;CRMP-2可以與驅(qū)動蛋白-1輕鏈作用而將管蛋白異二聚體或Sra-1連接至驅(qū)動蛋白-1(Kinesin-1),然后CRMP-2/Kinesin-1復(fù)合物可以將管蛋白等運輸?shù)捷S突遠端,但國內(nèi)有關(guān)CRMP-2與軸突生長的關(guān)系尚無相關(guān)研究。本實驗以原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)為研究模型,通過轉(zhuǎn)染野生型或失活型CRMP-2質(zhì)粒處理極性形成早期的神經(jīng)元,探討CRMP-2對海馬神經(jīng)元軸突生長的影響,為神經(jīng)元極性形成機制提供新的理論基礎(chǔ)。1海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染孕18d的SD大白鼠30只(由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供)。DMSO購于sigma公司。羊抗EGFP、鼠抗DsRed均購自Abcam(Cambridge,MA)、Tau-1抗體購自Millipore(Temecula,CA);Amaxa大鼠神經(jīng)元核電轉(zhuǎn)試劑盒(RatNeuronNucleofectorKit)購自Lonza(Cologne,Germany);RhodamineRed-X-,OregonGreen488購自MolecularProbes(Eugene,OR,USA)。Thewild-typeCRMP2(EGFP-wtCRMP2)andEGFP-T514DCRMP2突變體由美國Dr.K.Kaibuchi饋贈。無菌條件下取出孕18d胎鼠的完整腦組織,剔除腦膜和血管,鈍性分離出雙側(cè)海馬;將海馬剪成1mm3的組織塊(以上均在冰上進行),置入解剖液(含3-6%葡萄糖D-Hanks)中,0.125%胰蛋白酶(Gibco,USA)37℃消化15min,加入種植培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)終止反應(yīng),滴管吹打后經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過,1500r/min離心5min,加入適當(dāng)?shù)姆N植培養(yǎng)液重懸,細胞計數(shù),調(diào)至1×107/L,接種于預(yù)鋪多聚賴氨酸的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);4h后換成維持培養(yǎng)基(1%Glutamate/2%B27/97%NeurobasalMedia)。處理細胞吸出培養(yǎng)基,PBS漂洗后加入4%多聚甲醛常溫固定15～20min;PBS-0.1%Triton漂洗,然后PBS-0.5%Triton破膜5～10min,PBS-0.1%Triton漂洗,5%BSA封閉1h,分別滴加羊抗EGFP(1∶200)、兔抗DsRed(1∶1000)和鼠抗Tau-1(1∶200),于4℃孵育過夜,漂洗后分別加入熒光標記抗于室溫孵育1h,漂洗后50%甘油封片,于雙光子共聚焦顯微鏡下觀察。原代海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染率較低,為了得到比較高的轉(zhuǎn)染效率,我們選用了AmaxaBiosysterms公司NucleofectorⅡ電轉(zhuǎn)儀以及RatNeuronNucleofectorKit對剛分離的海馬神經(jīng)元進行核轉(zhuǎn)染。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件,全部數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示;采用Image-Proplus軟件統(tǒng)計突起長度。2結(jié)果2.1egfp和軸突標志物tau-1的表達原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)24h后采用核電轉(zhuǎn)實驗分別轉(zhuǎn)染EGFP,wtCRMP2和失活型T514D-CRMP2(突變體,模擬磷酸化失活型CRMP-2);第3d檢測CRMP-2對神經(jīng)元軸突生長的影響;培養(yǎng)72h固定做熒光三標,分別標記EGFP和軸突標志物Tau-1。轉(zhuǎn)染EGFP載體對照組神經(jīng)元正常發(fā)育,培養(yǎng)至48h,神經(jīng)元軸突特異性表達標志物蛋白Tau-1(圖1A,右側(cè)為局部放大圖)。過表達了野生型CRMP-2的神經(jīng)元除了生成一條長的特異性表達Tau-1的軸突(圖1B,局部放大1)外,另外一條突起也發(fā)育成了特異性表達Tau-1的軸突(圖1B,局部放大2);而過表達了失活型CRMP-2的神經(jīng)元發(fā)育與正常組相比無差異(圖1C),過表達了wtCRMP-2的神經(jīng)元平均軸突長度、軸突數(shù)目及多軸突神經(jīng)元所占比例均明顯增加,而失活型CRMP-2影響不大(圖1D～1F)。2.2機械神經(jīng)元運動學(xué)對照組平均軸突長度為185.4μm、軸突數(shù)目為1.1、軸突所占比例為10%;過表達野生型CRMP-2神經(jīng)元平均軸突長度為250.3μm、軸突數(shù)目為2.1、軸突所占比例為40%;而轉(zhuǎn)染突變體CRMP-2的神經(jīng)元神經(jīng)元平均軸突長度為180.0μm、軸突數(shù)目為0.9、軸突所占比例為9%(表1)。3調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突生長軸突生成是神經(jīng)元發(fā)生發(fā)展的必要過程,在許多神經(jīng)退行性疾病包括AD中,神經(jīng)元軸突營養(yǎng)不良可能會導(dǎo)致軸突退行性變和神經(jīng)元大量丟失,最后表現(xiàn)為認知和記憶障礙。因此促進軸突生成不僅可以阻止AD病人腦中神經(jīng)元軸突退行性變,而且還有可能促進退變軸突的再生。細胞內(nèi)神經(jīng)元突起或軸突生長需要兩種細胞骨架重組即肌絲和微管。微管的聚集存在于神經(jīng)元的胞體和生長錐。微管在軸突聚集通過2種方式:一種是微管聚合物的運輸;另一種是微管聚集加尾。這兩種方式都可以促進軸突的生長。其中微管相關(guān)蛋白,如Tau、MAP1A、MAP1B等蛋白分子在參與神經(jīng)元軸突微管聚集和組裝過程中起重要作用。但更多與軸突相關(guān)的微管相關(guān)蛋白在神經(jīng)元軸突生長中的作用尚不清楚。CRMPs家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中高度表達,尤其是腦組織發(fā)育的早期表達較多,該家族包括CRMP1-5共5個成員,它們作為突起生長的信號分子參與神經(jīng)元的發(fā)育過程。國外研究發(fā)現(xiàn):CRMP-2與管蛋白異二聚體相互作用而促進微管的聚集;CRMP-2通過與Numb以及重組肌絲的相互作用調(diào)節(jié)某些特異的黏附分子如L1的內(nèi)吞;CRMP-2可以與驅(qū)動蛋白-1輕鏈作用而將管蛋白異二聚體或Sra-1連接至驅(qū)動蛋白-1(Kinesin-1),然后CRMP-2/Kinesin-1復(fù)合物可以將管蛋白等運輸?shù)捷S突遠端,但國內(nèi)有關(guān)CRMP-2與軸突生長的關(guān)系尚無相關(guān)研究。我們通過轉(zhuǎn)染外源性DNA上調(diào)或下調(diào)CRMP-2表達水平,檢測了其對神經(jīng)元軸突生長的影響。